Reactivo que comprende un activador de la coagulación capaz de permitir la evaluación del potencial hemostático de una muestra de sangre o plasma,

en el que el activador de la coagulación es una tromboplastina y en el que la concentración del activador de la coagulación es 11 picomolar o menos

Un reactivo y un estuche para determinar la coagulabilidad global y el potencial hemostático.

Campo de la invención

La invención se dirige a un reactivo y un estuche para determinar si un paciente es hipercoagulable, hipocoagulable o normal en una sola prueba sobre una muestra procedente del paciente. La invención permite determinar globalmente tanto el potencial hipercoagulable como el potencial hipocoagulable de un paciente en un solo ensayo.

Antecedentes de la invención

La hemostasis es todo el proceso fisiológico para mantener la sangre en estado fluido dentro de vasos sanguíneos intactos y prevenir la pérdida de sangre excesiva al detener el flujo a través de la formación de un tapón hemostático. La hemostasis normal se mantiene mediante interacciones estrechamente reguladas de la pared de los vasos sanguíneos, las plaquetas de la sangre y las proteínas del plasma sanguíneo. Bajo condiciones normales, hay un delicado equilibrio entre los componentes individuales del sistema hemostático. Cualesquiera perturbaciones en este equilibrio hemostático, el potencial hemostático, podrían dar como resultado hemorragia o trombosis, Figura 1. Por "potencial hemostático" se entiende la capacidad para mantener un equilibrio entre los estados procoagulante y anticoagulante, según se mide por la polimerización de fibrina, cuando la coagulación es iniciada por un accionador o activador.

Una tendencia trombótica (trombofilia) resulta de la generación de actividad de trombina en exceso y polimerización de fibrina y formación de coágulos incrementadas (hipercoagulabilidad) mientras que una tendencia a hemorragias (hemofilia) resulta de una generación de trombina insuficiente y una polimerización de fibrina y formación de coágulos reducidas (hipocoagulabilidad). Todavía no existe un solo parámetro de laboratorio que se incremente en todas las formas de hipercoagulabilidad y disminuya en todas las forma de hipocoagulabilidad. Esto se debe en parte a factores distintos al plasma que representan un papel en la hemostasis. Según se describió anteriormente, estos otros factores incluyen la pared de los vasos sanguíneos y las plaquetas. Sin embargo, grandes proporciones de los trastornos hemostáticos están relacionadas con defectos o deficiencias en las proteínas de la sangre que constituyen el sistema de coagulación. Estas proteínas son responsables de la estabilización del tapón plaquetario mediante la formación de fibrina. Por lo tanto, una medida global de la contribución del plasma a la coagulación facilitaría la investigación de pacientes con hemostasis alterada.

La trombofilia y la hemofilia pueden ser congénitas o adquiridas. Las formas congénitas tienen una base genética y por lo tanto no se corrigen fácilmente. Las formas adquiridas resultan generalmente de cambios ambientales, a menudo el efecto de fármacos, y por lo tanto son susceptibles de manipulación. Por ejemplo, un individuo normal al que se administra warfarina desarrolla hemofilia adquirida, interrumpir la warfarina elimina la afección. Un individuo normal al que se administra una alta dosis de estrógeno desarrolla trombofilia adquirida, interrumpir el estrógeno elimina la afección. La base fundamental de las trombofilias y hemofilias tanto congénitas (genéticas) como adquiridas (ambientales) es un cambio bien en la cantidad o bien en la actividad de uno o más compuestos clave de la ruta de la coagulación. Por ejemplo, la forma hereditaria más comúnmente reconocida de trombofilia es una mutación en el gen del factor V que da como resultado la producción de una proteína del factor V estructuralmente alterada (Factor V Leiden) que es resistente a la segmentación enzimática por proteína C, un componente regulador crítico. La hemofilia A clásica se debe a una mutación en el gen del factor VIII que da como resultado bien una producción reducida de factor VIII o bien una producción de una proteína del factor VIII estructuralmente alterada que no funciona correctamente. En contraste con las trombofilias y hemofilias congénitas, las formas adquiridas no resultan de una estructura alterada sino en cambio de una alteración de la cantidad de un componente clave, típicamente más de uno, en un momento. Por ejemplo, el efecto trombofílico del estrógeno se debe a los efectos combinados de un aumento en los factores XI, IX, VIII, II y fibrinógeno y una reducción en la proteína S anticoagulante. El efecto hemofílico de la warfarina se debe a una reducción en los factores II, VII, IX y X. La Figura 2 ilustra los diversos estados de coagulabilidad y lista ejemplos de ensayos usados para determinar el grado o la presencia de un desequilibrio. Hoy día no existe un ensayo que pueda usarse para determinar tanto la hiper como la hipocoagulabilidad simultáneamente. Esto se debe en parte a la complejidad del procedimiento de coagulación, la interdependencia de los diversos componentes y la identificación de un medio para verificar el potencial hemostático de todo el sistema de coagulación. La Figura 3 presenta una visión de conjunto del proceso de coagulación. El proceso puede dividirse en cuatro fases dependientes, (1) la fase de iniciación, (2) la fase de propagación, (3) la fase de amplificación y (4) la fase de polimerización. Todas las fases están afectadas por procesos reguladores y de retroalimentación denominados rutas anticoagulantes.

La iniciación o el accionamiento de la coagulación se produce mediante la exposición de factor tisular debido a daño vascular, ruptura de la placa o expresión de monocitos como resultado de la inflamación. Cantidades traza de FVIIa y factor tisular forman el complejo Xasa extrínseca. Este complejo potencia la actividad catalítica de VIIa hacia factores X y IX dando como resultado la formación de las enzimas activas Xa y IXa. El factor Xa generado por el complejo Xasa extrínseca forma una pequeña cantidad de trombina (IIa). La trombina generada es capaz de activar pequeñas cantidades de los cofactores VIII y V. In vivo, el complejo Xasa extrínseca es rápidamente desactivado por el inhibidor del factor de la ruta tisular, TFPI, a través de la formación de un complejo cuaternario que consiste en TF, VIIa y Xa. Bajo condiciones fisiológicas la Xasa extrínseca genera cantidades solo picomolares de trombina.

Durante la fase de propagación de la coagulación, el papel de la Xasa extrínseca se minimiza y Factor Xa es generado alternativamente por el complejo de las enzimas IXa y su cofactor VIIIa. Este complejo enzimático se denomina Xasa intrínseca. La formación del Xa por el complejo Xasa intrínseca es aproximadamente 50 veces más eficaz que por la Xasa extrínseca. El Factor Xa y su cofactor activado, FVa, forman un complejo sobre la superficie de plaquetas activadas. Este es un catalizador eficaz para la conversión de protrombina en trombina, denominada el complejo protrombinasa. La trombina formada a través del complejo Xasa intrínseca es capaz de amplificar su propia producción mediante retroalimentación positiva (activación). La trombina activa los Factores VIII y V y la activación del Factor XI conduce a una producción adicional del componente enzimático de Xasa intrínseca (Factor IXa). La producción normal de trombina está altamente regulada y localizada. El TFPI neutraliza el accionamiento para la generación de trombina. Las proteasas activas (IIa, Xa, IXa) deben ser desactivadas por inhibidores de proteasa para evitar la trombosis diseminada. Uno de los más significativos de estos inhibidores es antitrombina III (ATIII). Tanto la trombina como el Xa, y en una menor extensión IXa liberado de superficies de membranas, son rápidamente inhibidos por ATIII. La trombina también puede unirse a subendotelio no dañado a través de una molécula receptora, la trombomodulina (TM). La formación del complejo IIa/TM cambia la especificidad de sustrato de la trombina de un procoagulante a un anticoagulante. La trombina unida a TM es un potente activador de proteína C, convirtiéndola en la enzima activa proteína C activada (APC). La APC junto con su cofactor proteína S segmenta los cofactores activados FVIIIa y FVa dando sus formas inactivas, FVIIIi y FVi. La trombomodulina también acelera la desactivación de trombina por ATIII.

La formación de trombina conduce finalmente a la segmentación de fibrinógeno para formar fibrina. Durante la fase de polimerización, la reticulación de hebras de fibrina solubles está mediada por Factor XIIIa, una enzima generada por activación de trombina. El complejo trombina-TM activa la procarboxipeptidasa inhibidor de la fibrinolisis activado portrombina (TAFI). Así, la trombina representa un papel durante esta fase al... [Seguir leyendo]

1. Reactivo que comprende un activador de la coagulación capaz de permitir la evaluación del potencial hemostático de una muestra de sangre o plasma, en el que el activador de la coagulación es una tromboplastina y en el que la concentración del activador de la coagulación es 11 picomolar o menos.

2. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la tromboplastina es factor tisular.

3. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el factor tisular comprende factor tisular recombinante o purificado, factor tisular truncado o células que expresan factor tisular sobre su superficie.

4. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en el que el factor tisular está presente en una concentración de 6 picomolar o menos.

5. Reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el reactivo comprende además vesículas o liposomas y un catión metálico o una sal metálica, que se disocia en un catión metálico.

6. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el catión metálico es un catión metálico divalente seleccionado de magnesio, calcio o manganeso.

7. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en el que las vesículas comprenden fosfolípidos.

8. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 7, en el que los fosfolípidos comprenden fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina o mezclas de las mismas.

9. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la mezcla de fosfolípidos comprende la totalidad de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina y en una relación de aproximadamente 1 a 10 por ciento en moles de fosfatidilserina y de aproximadamente 5 a 30 por ciento en moles de fosfatidiletanolamina y el resto fosfatidilcolina.

10. Reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el reactivo comprende además un activador de una ruta anticoagulante.

11. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el activador de la ruta anticoagulante es un activador de proteína C.

12. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el activador de proteína C es trombomodulina humana purificada, trombomodulina de mamífero no humano purificada, trombomodulina soluble o asociada a la membrana, trombomodulina natural o trombomodulina reconstituida con fosfolípidos, trombomodulina parcialmente glicosilada, trombomodulina completamente glicosilada o trombomodulina completamente desglicosilada.

13. Reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el reactivo comprende además tampones y/o estabilizantes.

14. Reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde el reactivo es capaz de indicar que un paciente, del que se toma la muestra, tiene cualquier tendencia trombótica, tendencia hemorrágica o coagulabilidad normal, dependiendo del paciente.

15. Estuche para evaluar el potencial hemostático de una muestra de prueba que comprende un activador de la coagulación, que es una tromboplastina, en una concentración de 11 picomolar o menos;

vesículas; y

un catión metálico divalente o una sal metálica capaz de disociarse en un catión metálico divalente.

16. Estuche de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la tromboplastina es factor tisular.

17. Estuche de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el factor tisular comprende factor tisular recombinante o purificado, factor tisular truncado o células que expresan factor tisular sobre su superficie.

18. Estuche de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15-17, en donde el estuche comprende además un activador de una ruta anticoagulante.

19. Estuche de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el activador de la ruta anticoagulante es un activador de proteína C.

20. Estuche de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el activador de proteína C es trombomodulina humana purificada, trombomodulina de mamífero no humano purificada, trombomodulina soluble o asociada a la membrana, trombomodulina natural o trombomodulina reconstituida con fosfolípidos, trombomodulina parcialmente glicosilada, trombomodulina completamente glicosilada o trombomodulina completamente desglicosilada.

21. Estuche de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la trombomodulina se relipida con fosfolípidos que comprenden al menos 10% de fosfatidiletanolamina.

22. Estuche de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15-21, en donde el estuche comprende además fosfolípidos en una concentración de 10 a 300 micromolar.

23. Estuche de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15-22, en el que las vesículas comprenden plaquetas, residuo celular, vesículas fosfolipídicas o micropartículas plaquetarias.

24. Uso de un reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 en un solo ensayo para determinar una condición hipercoagulable, de coagulabilidad normal o hipocoagulable.

25. Uso de un estuche de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15-23 en un solo ensayo para determinar una condición hipercoagulable, de coagulabilidad normal o hipocoagulable.