SÍNTESIS DE OLIGOSACÁRIDOS, GLICOLÍPIDOS Y GLICOPROTEÍNAS USANDO GLICOSILTRANSFERASAS BACTERIANAS.

Síntesis de oligosacáridos, glicolípidos y glicoproteínas usando glicosiltransferasas bacterianas Campo de la invención [0001] La presente invención proporciona secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de fucosiltransferasas de Helicobacter pylori. La invención proporciona también métodos para usar las fucosiltransferasas con el fin de sintetizar oligosacáridos, glicoproteínas, y glicolípidos. Antecedentes de la invención ES 2 365 393 T3 [0002] Aunque en los últimos años se han realizado avances significativos en la química de carbohidratos, existen todavía dificultades sustanciales asociadas a la síntesis química de glicoconjugados, particularmente con la formación del enlace ß-1,2-cis-manósido ubicuo que se encuentra en oligosacáridos de mamíferos. Por otra parte, en cada etapa de la síntesis de novo de un carbohidrato deben resolverse obstáculos regio- y estéreo-químicos. [0003] A la vista de las dificultades asociadas a la síntesis química de glicoconjugados, el uso de glicosiltransferasas para sintetizar enzimáticamente glicoproteínas y glicolípidos, que tengan fracciones de oligosacáridos deseadas, es un planteamiento prometedor para preparar dichos glicoconjugados. Las síntesis basadas en enzimas tienen las ventajas de la regioselectividad y la estereoselectividad y se pueden llevar a cabo usando sustratos no protegidos. Por otra parte, las glicosiltransferasas se han usado para modificar enzimáticamente fracciones de oligosacáridos y han demostrado ser muy eficaces para producir productos específicos con un buen control estereoquímico y regioquímico. Las glicosiltransferasas de interés incluyen fucosiltransferasas, sialiltransferasas, galactosiltransferasas, y Nacetilglucosaminiltransferasas. Para consultar una revisión general, véanse, Crout et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 98­ 111 (1998) y Arsequell, et al., Tetrahedon: Assymetry 10: 2839 (1997). [0004] Muchas glicoproteínas y glicolípidos requieren la presencia de una glicoforma particular, o la ausencia de una glicoforma particular, con el fin de presentar una actividad biológica particular. Por ejemplo, muchas glicoproteínas y glicolípidos requieren la presencia de estructuras fucosiladas particulares para presentar actividad biológica. Los mecanismos de reconocimiento intercelular requieren frecuentemente un oligosacárido fucosilado. Por ejemplo, varias glicoproteínas que funcionan como moléculas de adhesión celular, incluyendo P-selectina, L-selectina, y E-selectina, se unen a estructuras de carbohidratos fucosiladas, específicas, de la superficie celular, tales como las estructuras de sialil Lewis-x y sialil Lewis-a. Adicionalmente, las estructuras de carbohidratos específicas que forman el sistema de grupos sanguíneos ABO están fucosiladas. Las estructuras de carbohidratos en cada uno de los tres grupos comparten una unidad Fuc1,2Galß1-disacárido. En estructuras del grupo sanguíneo O, este disacárido es la estructura terminal; mientras que la estructura del grupo sanguíneo A está formada por una 1,3Ga1NAc transferasa que añade un residuo de GalNAc terminal al disacárido; y la estructura del grupo sanguíneo B está formada por una 1,3 galactosiltransferasa que añade un residuo de galactosa terminal. [0005] Las estructuras del grupo sanguíneo de Lewis se pueden someter también a fucosilación. Por ejemplo, las estructuras de Lewis-x y Lewis-a son respectivamente Galß1,4(Fuc1,3)GlcNac y Galß1,3(Fuc1,4)GlcNac. Ambas estructuras mencionadas se pueden además a sialilación (NeuAc2,3-) para formar las estructuras sialiladas correspondientes. Otras estructuras del grupo sanguíneo de Lewis de interés son las estructuras de Lewis-y y Lewis-b que son respectivamente Fuc1,2Galß1,4(Fuc1,3)GlcNAcß-OR y Fuc1,2Galß1,3(Fuc1,4)Glc-NAc-OR. Para obtener una descripción de las estructuras del ABO y las estructuras del grupo sanguíneo de Lewis y las enzimas involucradas en su síntesis, véanse, Essentials of Glycobiology, Varki et al. eds., Capítulo 16 (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1999). [0006] Específicamente, se han usado fucosiltransferasas en rutas de síntesis para transferir un residuo de fucosa de guanosina-5-difosfofucosa a un hidroxilo específico de un aceptor sacárido. Se conoce una variedad de sustratos dadores y sustratos aceptores (véase Guo et al., Applied Biochem. and Biotech. 68: 1-20 (1997)). Por ejemplo, Ichikawa preparó sialil Lewis-x mediante un método que conlleva la fucosilación de lactosamina sialilada, con una fucosiltransferasa clonada (Ichikawa et al., J. Am. Chem. Soc. 114: 9283-9298 (1992)). Lowe ha descrito un método para expresar actividad de fucosilación no nativa en células, produciendo de este modo glicoproteínas fucosiladas en superficies celulares, etcétera (Patente U.S. No. 5.955.347). [0007] De este modo, puesto que la actividad biológica de muchas glicoproteínas y glicolípidos producidos de manera recombinante y transgénica, comercialmente importantes, depende de la presencia de una glicoforma particular, o la ausencia de un glicoforma particular, existe una necesidad de un método eficaz para sintetizar enzimáticamente glicoconjugados que tengan las fracciones de oligosacáridos fucosiladas deseadas. Adicionalmente, existe una necesidad de producción eficaz de oligosacáridos fucosilados. La presente invención satisface esta y otras necesidades. 2 Breve resumen de la invención [0008] La presente invención proporciona proteínas y ácidos nucleicos de -1,3/4-fucosiltransferasa de H. pylori. Las proteínas -1,3/4-fucosiltransferasa catalizan la transferencia de un residuo de fucosa desde un sustrato dador a un sustrato aceptor. En una realización, la invención proporciona ácidos nucleicos de -1,3/4-fucosiltransferasa con una secuencia de nucleótidos según la ID SEC N.º:1 que codifican proteínas de -1,3/4-fucosiltransferasa que transfieren fucosa a residuos de GIcNAc. [0009] En otra realización, el ácido nucleico de -1,3/4-fucosiltransferasa se presenta según la ID SEC N.º:1. La invención proporciona también secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas de -1,3/4-fucosiltransferasa, que incluyen la ID SEC N.º:2, y que catalizan la transferencia de fucosa a un residuo de N-acetilglucosamina o a un residuo de glucosa. En un aspecto, la -1,3/4-fucosiltransferasa codificada incluye también una etiqueta de aminoácidos. [0010] En otra realización, la invención proporciona vectores de expresión que incluyen los ácidos nucleicos de -1,3/4fucosiltransferasa antes descritos, células hospedadoras que incluyen los vectores de expresión, y métodos para producir las proteínas de -1,3/4-fucosiltransferasa usando las células hospedadoras cultivadas bajo condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de -1,3/4-fucosiltransferasa. [0011] En otra realización, la invención proporciona proteínas de fucosiltransferasa recombinantes que incluyen una secuencia de aminoácidos según la ID SEC N.º:2 en donde la fucosiltransferasa cataliza la transferencia de un residuo de fucosa desde un sustrato dador a N-acetilglucosamina. En un aspecto, las proteínas de fucosiltransferasa comprenden la ID SEC N.º:2. En otro aspecto, las proteínas de fucosiltransferasa incluyen también una etiqueta de aminoácidos. [0012] La presente invención proporciona también métodos para usar la proteína de -1,3/4-fucosiltransferasa anterior con el fin de producir oligosacáridos fucosilados. Los oligosacáridos fucosilados se pueden purificar adicionalmente. El sustrato aceptor puede ser N-acetilglucosamina. En una realización, el sustrato aceptor es Lacto-N-neo-Tetraosa (LNnT) y el producto fucosilado es Lacto-N-Fucopentaosa III (LNFP III). La -1,3/4-fucosiltransferasa se puede usar en combinación con otras glicosiltransferasas para producir un oligosacárido fucosilado. Por ejemplo, usando lactosa como material de partida, se puede producir LNFP a través de la acción de una -1,3/4-fucosiltransferasa que transfiere fucosa a N-acetilglucosamina, una ß-1,3-N-acetilglucosaminiltransferasa, y una ß-1,4-galactosiltransferasa. La ß-1,3acetilglucosaminiltransferasa y la ß-1,4-galactosiltransferasa pueden ser enzimas bacterianas y, en una realización preferida, son de Neisseria gonococcus. [0013] En otra realización, la proteína de -1,3/4-fucosiltransferasa de la presente invención se usa para producir glicolípidos fucosilados. El sustrato aceptor puede ser N-acetilglucosamina. [0014] En otra realización, la presente invención proporciona un método para producir una glicoproteína fucosilada, combinando una -1,3/4-fucosiltransferasa descrita en el presente documento con una glicoproteína que incluye un sustrato aceptor apropiado, bajo condiciones adecuadas para producir una glicoproteína fucosilada. El sustrato aceptor se puede seleccionar de entre Galß1-OR, Gal,3/4GlcNAc-OR, NeuAc2,3Galß1,3/4GlcNAc-Or,... [Seguir leyendo]

1. Método de creación de una glicoforma sustancialmente uniforme de un oligosacárido fucosilado, comprendiendo el método: hacer entrar en contacto una 1,3-fucosiltransferasa recombinante de la cepa 1182B de Helicobacter pylori con una mezcla que comprende un sustrato dador que comprende un residuo de fucosa, y un sustrato aceptor que comprende un azúcar u oligosacárido que comprende por lo menos un residuo de Nacetilglucosamina, bajo condiciones en las que la 1,3-fucosiltransferasa cataliza la transferencia de fucosa preferentemente al residuo de N-acetilglucosamina, produciendo de este modo una glicoforma sustancialmente uniforme de un oligosacárido fucosilado, en donde la 1,3-fucosiltransferasa está codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que tiene la secuencia de la Figura 1 ó tiene la secuencia de aminoácidos de la Figura 1 y en donde el sustrato aceptor es Lacto-N-neo-Tetraosa (LNnt). 2. Método de la reivindicación 1, en el que el método comprende además una etapa de purificación del oligosacárido fucosilado. 3. Método de la reivindicación 1, en el que el sustrato dador es GDP-fucosa. 4. Método de la reivindicación 1, en el que la fucosiltransferasa comprende una etiqueta de aminoácidos. 5. Método de la reivindicación 1, en el que el sustrato aceptor se fija a una glicoproteína. 6. Método de la reivindicación 1, en el que el oligosacárido fucosilado es Lacto-N-Fucopentaosa III (LNFP III). 7. Método de la reivindicación 1, en el que la mezcla comprende además lactosa, una ß-1,3-Nacetilglucosaminiltransferasa, y una ß-1,4-galactosiltransferasa. 8. Método de la reivindicación 7, en el que la ß-1,3-N-acetilglucosaminiltransferasa es una enzima bacteriana. 9. Método de la reivindicación 8, en el que la ß-1,3-N-acetilglucosaminiltransferasa es de Neisseria gonococcus. 10. Método de la reivindicación 7, en el que la ß-1,4-galactosiltransferasa es una enzima bacteriana. 11. Método de la reivindicación 10, en el que la ß-1,4-galactosiltransferasa es de Neisseria gonococcus. 12. Método de la reivindicación 7, en el que el oligosacárido fucosilado es Lacto-N-Fucopentaosa III (LNFP III). 31 ES 2 365 393 T3 32 ES 2 365 393 T3 33 ES 2 365 393 T3 34 ES 2 365 393 T3 ES 2 365 393 T3 36 ES 2 365 393 T3 37 ES 2 365 393 T3 38 ES 2 365 393 T3 39 ES 2 365 393 T3 ES 2 365 393 T3 41 ES 2 365 393 T3 42 ES 2 365 393 T3 43 ES 2 365 393 T3 44 ES 2 365 393 T3 ES 2 365 393 T3 46 ES 2 365 393 T3 47 ES 2 365 393 T3 48 ES 2 365 393 T3 49 ES 2 365 393 T3 ES 2 365 393 T3 51 ES 2 365 393 T3 52 ES 2 365 393 T3 53