PRODUCCIÓN DE VACUNAS DE VIRUS PARAINFLUENZA ATENUADO A PARTIR DE SECUENCIAS DE NUCLEÓTIDOS CLONADAS.

Una molécula polinucleotídica aislada que comprende un promotor de la transcripción unido operativamente,

una secuencia polinucleotídica que codifica un genoma o antigenoma de PIV y un terminador de la transcripción, en la que dicha secuencia polinucleotídica que codifica dicho genoma o antigenoma de PIV se selecciona del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 14 y SEC ID Nº: 15, o la secuencia complementaria de las mismas, y está modificada por introducción de una secuencia de PIV heteróloga seleccionada de una secuencia de HPIV1, una secuencia de HPIV2 o una secuencia de BPIV para formar un genoma o antigenoma de PIV quimérico

Antecedentes de la invención

Los virus parainfluenza humanos (HPIV), HPIV1, HPIV2 y HPIV3, son causas significativas de bronquiolitis, difteria y neumonía en lactantes y niños. Karron et al., J. Infect. Dis. 172: 1445-50 (1995); Collins et al. “Parainfluenza Viruses”, págs. 1205-1243. En B.N. Fields et al., eds., Fields Virology, 3ª ed, vol. 1. Lippincott-Raven Publ., Filadelfia (1996); Murphy et al., Virus Res. 11: 1-15 (1988). Las infecciones por estos virus dan como resultado una morbilidad importante en niños menores de 3 años de edad y son responsables de aproximadamente el 20% de las hospitalizaciones entre lactantes y niños pequeños por infecciones del tracto respiratorio.

A pesar de los considerables esfuerzos por desarrollar terapias vacunales eficaces contra HPIV, no se han logrado todavía agentes vacunales autorizados para ninguna cepa de HPIV, ni para mejorar enfermedades relacionadas con HPIV. Hasta la fecha sólo dos candidatos a vacunas de PIV vivas atenuadas han recibido una atención particular. Uno de estos candidatos es una cepa de PIV bovino (BPIV) que está antigénicamente relacionada con el HPIV3, y que ha demostrado proteger a los animales frente al HPIV3. El BPIV3 está atenuado, es genéticamente estable e inmunogénico en lactantes y niños humanos (Karron et al., J. Inf. Dis. 171: 1107-14 (1995a); Karron et al., J. Inf. Dis. 172: 1445-1450, (1995b)). Un segundo candidato a vacuna de PIV3, JS cp45 es un mutante adaptado al frío de la cepa de tipo silvestre (wt) JS del HPIV3 (Karron et al., (1995b), anteriormente; Belshe et al., J. Med. Virol. 10: 235-42 (1982)). Este candidato a vacuna de PIV3 viva atenuada pasada en frío (cp) presenta fenotipos termosensibles (ts), de adaptación al frío (ca) y de atenuación (att) que son estables después de la replicación viral in vivo. El virus cp45 protege frente a la exposición a PIV3 humano en animales de experimentación y está atenuado, es genéticamente estable e inmunogénico en lactantes y niños humanos seronegativos (Hall et al., Virus Res. 22: 173-184 (1992); Karron et al., (1995b), anteriormente).

El HPIV3 es un miembro del género Paramyxovirus de la familia Paramyxovirus, orden Mononegavirales. Su genoma es una sola cadena de ARN de sentido negativo de 15462 nucleótidos (nt) de longitud (Galinski et al., Virology 165: 499-510, (1988); Stokes et al., Virus Res. 25: 91-103 (1992)) y codifica al menos ocho proteínas (Collins et al., anteriormente, (1996); Galinski, anteriormente, (1991); Spriggs y Collins, J. Gen. Virol. 67: 2705-2719, (1986)). Tres de estas proteínas se asocian con el genoma de ARN para formar la nucleocápside; en concreto, la proteína de la nucleocápside N, la fosfoproteína P y la subunidad grande de la polimerasa L. Tres proteínas adicionales se asocian con la envuelta, en concreto la proteína de la matriz M, que ha demostrado mediar la unión y la liberación viral, la proteína hemaglutinina-neuraminidasa HN y la proteína de fusión F. Otras dos proteínas, HN y F, representan los antígenos neutralizantes y protectores de los PIV (Collins et al. En Fields Virology, 3ª ed., 1: 120543 (1996)). La divergencia de secuencia significativa en estos dos antígenos protectores entre diferentes PIV es la base para la especificidad de inmunidad protectora tipo contra estos patógenos (ídem).

Otra proteína de PIV, la proteína C, está codificada por una fase de lectura abierta (ORF) solapante del ARNm de la proteína P (Spriggs y Collings, 1986) y la proteína D se genera por edición del ARN del cistrón P (Galinski et al. Virology 186: 543-50 (1992)). El ARNm de P también contiene una ORF interna que tiene el potencial de codificar un dominio rico en cisteína denominado V. La ORF V también se encuentra en otros paramixovirus y, típicamente, se accede a la misma por edición del ARN, pero éste no es el caso del PIV. Actualmente, no se sabe si se expresa la ORF V del PIV.

El genoma viral de PIV también contiene regiones líder y tráiler extragénicas, que poseen promotores necesarios para la replicación y transcripción viral. Por lo tanto, el mapa genético del PIV está representado como 3' líder-N-P/C/D-M-F-HN-L-tráiler. La transcripción se inicia en el extremo 3' y avanza mediante un mecanismo de terminación-inicio secuencial que está guiado por motivos conservados cortos que se encuentran en los límites de los genes. El extremo cadena arriba de cada gen contiene una señal de inicio de gen (GS), que dirige el inicio de su ARNm respectivo. El extremo terminal cadena abajo de cada gen contiene un motivo de final de gen (GE) que dirige la poliadenilación y la terminación.

La identificación de mutaciones atenuantes en cp45 y otros candidatos a vacunas de PIV3 es de interés por una diversidad de razones (documento WO 97 20468 A). En particular, será útil para comprender la base genética de la atenuación y para caracterizar la virología molecular y la patogénesis de cepas de HPIV3 atenuadas para proporcionar vacunas clínicamente aceptables para usar contra estos y otros paramixovirus, especialmente HPIV1 y HPIV2, que en conjunto representan un 7% adicional de los ingresos hospitalarios pediátricos. Para conseguir estos objetivos y objetivos relacionados, es necesario un método para producir virus con un fenotipo wt a partir de ADNc para determinar qué mutación o mutaciones en el virus cp45 especifican los fenotipos ts, ca y att y qué gen o genes del BPIV3 especifican el fenotipo de atenuación. [0007] Las secuencias de nucleótidos completas de la cepa de PIV3 prototipo, y de las cepas cp45 y HPIV3 JS wt se han determinado (Stokes et al., anteriormente, (1992); Stokes et al., Virus res. 30: 43-52 (1993)). A partir de estos estudios, se demostró que la cepa cp45 poseía al menos diecisiete sustituciones de nucleótidos en comparación con la cepa de HPIV3 JS wt parental, estando ocho de las mismas correlacionadas con cambios en proteínas virales. Sin embargo, no se ha mostrado previamente cuáles de estas mutaciones identificadas especifican los fenotipos deseados, por ejemplo, ts, ca y att. Recientemente, se describió que el crecimiento de cp45 a temperaturas no permisivas estaba complementado por la coexpresión de un clon de ADNc del gen de L de la cepa de PIV3 wt 47885 (Ray et al., J. Virol. 70: 580-584 (1996)), sugiriendo que el gen de L puede contener una o más mutaciones que contribuyen al fenotipo ts de cp45. Sin embargo, los resultados de este estudio se complican por el hecho de que la cepa 47885 no es isogénica con la parental JS de cp45 (por ejemplo, los dos virus son un 4% diferentes a nivel de nucleótidos y las proteínas L difieren en 41 posiciones de aminoácidos (Stokes et al., anteriormente, (1992); la fe de erratas aparece en Virus Res. 27: 96 (1993); Virus Res. 25: 91-103). Además, este método de complementación no proporciona una medición clara de la contribución relativa de la mutación o mutaciones del gen de L al fenotipo ts global de cp45.

El rescate y el análisis de mutaciones atenuantes en PIV3 y otros virus ARN requieren métodos eficaces para manipular ADNc para los virus de interés particulares. A pesar de los avances previos que identificaban ADNc para PIV, la manipulación del ARN genómico de este y otros virus ARN de sentido negativo ha demostrado ser difícil. Un obstáculo principal a este respecto es que el ARN genómico desnudo de estos virus no es infeccioso.

Sólo recientemente han comenzado a desarrollarse métodos exitosos para la manipulación genética directa de virus ARN de cadena negativa no segmentada (para revisiones, véase Conzelmann, J. Gen. Virol. 77: 381-89 (1996); Palese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 11354-58, (1996)) (véase también el documento EP 0 702 085 A y EP 0 440 219 A). Se han generado con éxito nucleocápsides funcionales a partir de la coexpresión intracelular de plásmidos transfectados por separado que llevan el promotor de la ARN polimerasa de T7 y que codifican ARN genómico o antigenómico y las proteínas N, P y L. La expresión de ADNc intracelular se dirige mediante ARN polimerasa de T7, que se produce por coinfección con un virus vaccinia recombinante. Esta estrategia se usó por primera vez para determinar las necesidades de transcripción y replicación de minirreplicones codificados por ADNc. Se han conseguido algunos éxitos en la aplicación de estos métodos generales para rescatar virus de la rabia, virus de la estomatitis vesicular (VSV), virus del sarampión y virus Sendai infecciosos a partir de ARN antigenómico codificado por ADNc en presencia de la nucleocápside N, la fosfoproteína P y la subunidad grande de la polimerasa L (Garcin et al., EMBO J. 14: 6087-6094 (1995); Lawson... [Seguir leyendo]

1. Una molécula polinucleotídica aislada que comprende un promotor de la transcripción unido operativamente, una secuencia polinucleotídica que codifica un genoma o antigenoma de PIV y un terminador de la transcripción, en la que dicha secuencia polinucleotídica que codifica dicho genoma o antigenoma de PIV se selecciona del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 14 y SEC ID Nº: 15, o la secuencia complementaria de las mismas, y está modificada por introducción de una secuencia de PIV heteróloga seleccionada de una secuencia de HPIV1, una secuencia de HPIV2 o una secuencia de BPIV para formar un genoma o antigenoma de PIV quimérico.

2. La molécula polinucleotídica aislada de la reivindicación 1, en la que la secuencia polinucleotídica que codifica el genoma o antigenoma incorpora un gen o segmento génico de BPIV.

3. La molécula polinucleotídica aislada de la reivindicación 1, que incorpora una secuencia heteróloga de un virus respiratorio sincitial o virus del sarampión.

4. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido que codifica el genoma o antigenoma de PIV quimérico está modificado adicionalmente por una inserción, reorganización, deleción o sustitución de nucleótido que especifica una alteración fenotípica seleccionada de atenuación, termosensibilidad, adaptación al frío, pequeño tamaño de placas, restricción del intervalo de hospedador o un cambio en un epítopo inmunogénico de PIV.

5. El polinucleótido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el genoma o antigenoma de PIV codifica una partícula de PIV infecciosa.

6. La molécula polinucleotídica aislada de la reivindicación 4 ó 5, en la que dicha secuencia polinucleotídica que codifica dicho genoma o antigenoma de PIV incorpora una o más mutaciones de JS cp45.

7. La molécula polinucleotídica aislada de la reivindicación 4 ó 5, en la que dicha secuencia polinucleotídica que codifica dicho genoma o antigenoma de PIV incorpora una mutación estabilizada por múltiples sustituciones de nucleótidos en un codón que especifica la mutación.

8. La molécula polinucleotídica aislada de la reivindicación 4 ó 5, en la que dicho genoma o antigenoma quimérico incorpora múltiples mutaciones, especificando cada una un fenotipo seleccionado de atenuación, termosensibilidad, adaptación al frío, pequeño tamaño de placas o restricción del intervalo de hospedador.

9. La molécula polinucleotídica aislada de la reivindicación 4 ó 5, en la que una mutación que especifica una alteración fenotípica seleccionada de atenuación, termosensibilidad, adaptación al frío, pequeño tamaño de placas, restricción del intervalo de hospedador o un cambio en un epítopo inmunogénico de PIV se incorpora en un fondo de PIV quimérico, que comprende un genoma o antigenoma que tiene uno o más de un gen o segmento génico de glicoproteína HN o F de PIV3 sustituido por uno o más genes o segmentos genómicos homólogos de glicoproteína HN y F de PIV1 o PIV2.

10. La molécula polinucleotídica aislada de la reivindicación 4 ó 5, que incorpora una secuencia reguladora de acción en cis de HPIV1, HPIV2 o BPIV.

11. La molécula polinucleotídica aislada de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, que incorpora una secuencia heteróloga de un virus respiratorio sincitial o virus del sarampión.

12. La molécula polinucleotídica aislada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que incorpora una secuencia polinucleotídica que codifica una molécula distinta de PIV seleccionada de una citocina, un epítopo T auxiliar, un marcador de sitio de restricción o una proteína de un patógeno microbiano capaz de generar una respuesta inmune protectora en un hospedador mamífero.

13. Una célula o composición sin células que incluye un vector de expresión que comprende una molécula polinucleotídica aislada que codifica un genoma o antigenoma de PIV y un vector de expresión que comprende una

o más moléculas polinucleotídicas aisladas que codifican proteínas N, P y L de PIV, en la que la molécula polinucleotídica que codifica dicho genoma o antigenoma de PIV se selecciona del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 14 y SEC ID Nº: 15, o la secuencia complementaria de las mismas, y está modificada por introducción de una secuencia de PIV heteróloga seleccionada de una secuencia de HPIV1, una secuencia de HPIV2 o una secuencia de BPIV para formar un genoma o antigenoma de PIV quimérico, de manera que la expresión de dicho genoma o antigenoma de PIV y proteínas N, P y L produce una partícula de PIV infecciosa.

14. La célula o composición sin células de la reivindicación 13, en la que la partícula de PIV infecciosa es un virus.

15. La célula o composición sin células de la reivindicación 13, en la que la partícula de PIV infecciosa es una partícula subviral.

16. Un método para producir una partícula de PIV infecciosa a partir de una o más moléculas polinucleotídicas aisladas que codifican dicho PIV, que comprende: coexpresar en una célula o sistema sin células un vector de expresión que comprende una molécula polinucleotídica que codifica un genoma o antigenoma de PIV y un vector de expresión que comprende una o más moléculas polinucleotídicas que codifican proteínas N, P y L, produciendo de este modo una partícula de PIV infecciosa en la que la molécula polinucleotídica que codifica dicho genoma o antigenoma de PIV se selecciona del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 14 y SEC ID Nº: 15, o la secuencia complementaria de las mismas, y está modificada por introducción de una secuencia de PIV heteróloga seleccionada de una secuencia de HPIV1, una secuencia de HPIV2 o una secuencia de BPIV para formar un genoma o antigenoma de PIV quimérico.

17. El método de la reivindicación 16, en el que la molécula polinucleotídica que codifica el genoma o antigenoma de PIV es ADNc.

18. El método de la reivindicación 16, en el que la partícula de PIV infecciosa es un virus.

19. El método de la reivindicación 16, en el que la partícula de PIV infecciosa es una partícula subviral.

20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que la molécula polinucleotídica que codifica el genoma o antigenoma de PIV quimérico es una quimera de secuencias de PIV humanas y bovinas.

21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en el que la molécula polinucleotídica que codifica el genoma o antigenoma de PIV incorpora además una mutación atenuante de una cepa de PIV derivada biológicamente.

22. El método de la reivindicación 21, en el que la molécula polinucleotídica que codifica el genoma o antigenoma de PIV incorpora al menos una mutación de JS cp45.

23. El método de la reivindicación 21 ó 22, en el que dicha molécula polinucleotídica que codifica el genoma o antigenoma de PIV incorpora una mutación que se estabiliza por múltiples sustituciones de nucleótidos en un codón que especifica la mutación.

24. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en el que una secuencia heteróloga de HPIV1 o HPIV2 que codifica un gen o segmento génico de una glicoproteína HN o F sustituye a un gen o segmento génico correspondiente de HPIV3.

25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24, en el que dicho genoma o antigenoma quimérico incorpora múltiples mutaciones, especificando cada una un fenotipo seleccionado de atenuación, termosensibilidad, adaptación al frío, pequeño tamaño de placas o restricción del intervalo de hospedador.

26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 25, en el que dicha molécula polinucleotídica que codifica dicho genoma o antigenoma de PIV incorpora una secuencia heteróloga de un virus respiratorio sincitial o virus del sarampión.

27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 26, en el que la molécula polinucleotídica que codifica el genoma o antigenoma de PIV está modificada para codificar una molécula distinta de PIV seleccionada de una citocina, un epítopo T auxiliar, un marcador de sitio de restricción o una proteína de un patógeno microbiano capaz de generar una respuesta inmune protectora en un hospedador mamífero.

28. Una partícula de PIV infecciosa, que comprende un genoma o antigenoma de PIV recombinante, una proteína N, una proteína P y una proteína L, en la que el genoma o antigenoma de PIV recombinante se selecciona del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 14 y SEC ID Nº: 15, o la secuencia complementaria de las mismas, y está modificado por introducción de una secuencia de PIV heteróloga seleccionada de una secuencia de HPIV1, una secuencia de HPIV2 o una secuencia de BPIV para formar un genoma o antigenoma de PIV quimérico.

29. La partícula de PIV infecciosa de la reivindicación 28, que es una partícula subviral.

30. La partícula de PIV infecciosa de la reivindicación 28, que es un virus.

31. La partícula de PIV infecciosa de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, en la que el genoma o antigenoma de PIV recombinante incorpora una secuencia heteróloga de RSV o virus del sarampión.

32. La partícula de PIV infecciosa de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, en la que el genoma o antigenoma de PIV recombinante comprende además una inserción, reorganización, deleción o sustitución de nucleótido que especifica una alteración fenotípica seleccionada de atenuación, termosensibilidad, adaptación al frío, pequeño tamaño de placas, restricción del intervalo de hospedador o un cambio en un epítopo inmunogénico de PIV.

33. La partícula de PIV infecciosa de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32, en la que el genoma o antigenoma de PIV recombinante incorpora al menos una mutación de JS cp45.

34. La partícula de PIV infecciosa de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 33, en la que una mutación que especifica una alteración fenotípica seleccionada de atenuación, termosensibilidad, adaptación al frío, pequeño tamaño de placas, restricción del intervalo de hospedador o un cambio en un epítopo inmunogénico de PIV está incorporada en un fondo de PIV quimérico que comprende un genoma o antigenoma que tiene uno o más genes o segmentos génicos de glicoproteína HN o F de PIV3 sustituido por uno o más genes o segmentos génicos homólogos de glicoproteína HN y F de PIV1 o PIV2.

35. La partícula de PIV infecciosa de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 34, en la que el genoma o antigenoma de PIV recombinante está modificado para codificar una molécula distinta de PIV seleccionada de una citocina, un epítopo T auxiliar, un marcador de sitio de restricción o una proteína de un patógeno microbiano capaz de generar una respuesta inmune protectora en un hospedador mamífero.

36. La partícula de PIV infecciosa de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 35, en la que el genoma o antigenoma de PIV quimérico comprende además un polinucleótido que codifica un antígeno o epítopo de RSV que genera una inmunidad protectora contra RSV en un hospedador inmunizado.

37. La partícula de PIV infecciosa de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 35, en la que el genoma o antigenoma de PIV quimérico comprende además un polinucleótido que codifica un antígeno o epítopo del virus del sarampión.

38. Una composición inmunogénica que comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de una partícula de PIV infecciosa de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 37 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.