Método y dispositivo de nanogravimetría en medios fluidos basado en resonadores piezoeléctricos.

La invención proporciona un método, un dispositivo de caracterización electrónica y un soporte y celda de medida para monitorear un proceso químico o físico cuyo resultado puede evaluarse en términos de la variación de masa sobre un recubrimiento depositado sobre un sensor piezoeléctrico, enfrentado a un medio fluido cuyas características físicas permanecen estables. La invención aprovecha la deducción de una expresión analítica que establece una relación simple entre la variación de fase de una señal de frecuencia fija, que interroga al resonador piezoeléctrico, y la variación en la densidad de masa del recubrimiento. La invención tiene utilidad en aplicaciones en las que se utilizan resonadores piezoeléctricos para la caracterización de procesos bioquímicos y electroquímicos tales como: biosensores e inmunosensores piezoeléctricos, caracterización de procesos y materiales mediante electrogravimetría ac, detección de sustancias químicas o biológicas en disolución, entre otras

Método y dispositivo de nanogravimetría en medios fluidos basado en resonadores piezoeléctricos.

Objeto de la invención

La presente invención está relacionada con el campo de los sensores químicos, en particular con los que utilizan medidas eléctricas para detectar cambios extraordinariamente pequeños de masa, y más particularmente con los que utilizan como base los resonadores piezoeléctricos como micro ó nano-balanzas en medios líquidos.

Antecedentes de la invención

Los sensores de microbalanza, y entre ellos los basados en cristales de cuarzo piezoeléctrico, son dispositivos que se utilizan para medir de forma precisa variaciones en la masa depositada sobre ellos por unidad de superficie, a través de los cambios que sufre la frecuencia de resonancia de dichos cristales operando como resonadores. Dentro de la variedad de sensores de microbalanza existentes en el mercado, los denominados resonadores de cuarzo en corte AT (donde dicho tipo de corte corresponde a un corte según un ángulo de 35º15' de inclinación respecto al eje óptico z del cristal y perpendicular al plano y-z del mismo) se están convirtiendo en una herramienta analítica alternativa en una gran cantidad de aplicaciones, en las que se desea detectar la presencia de especies en disolución o caracterizar procesos químicos, con una resolución comparable en muchos casos a las técnicas químicas clásicas (Ver las referencias: A.W. Czanderna and C. Lu (1984) in "Applications of piezoelectric quartz crystal microbalances", C. Lu and A.W. Czanderna (eds), Elsevier, Amsterdam, Vol. 7; A. Janshoff, H-J Galla and C. Steinem (2000) "Piezoelectric mass-sensing devices as biosensors-an alternative to optical biosensors?" Angew. Chem. Int. Ed. 39:4004-4032; MA. Cooper and VT. Singleton (2007) "A survey of the 2001 to 2005 quartz crystal microbalance biosensor literature: applications of acoustic physics to the analysis of biomolecular interactions" Journal of Molecular Recognition 20 (3):154-184; TA. Camesano, YT. Liu and M. Datta (2007) "Measuring bacterial adhesion at environmental interfaces with single-cell and single-molecule techniques" Advances in Water Resources 30 (6-7):1470-1491; O. Lazcka, FJ. Del Campo and FX, Muñoz (2007) "Pathogen detection: A: perspective of traditional methods and biosensors" Biosensors & Bioelectronics 22 (7):1205-1217; TS. Hug (2003) "Biophysical methods fro monitoring cell-substrate interactions in drug discovery" Assay and Drug Development Technologies 1 (3): 479-488; FL. Dickert, P. Lieberzeit and 0. Hayden (2003) "Sensor strategies for micro-organism detection - from physical principles to imprinting procedures" Analytical and Bioanalytical Chemistry 377 (3):540-549; KA. Marx (2003) "Quartz crystal microbalance: A useful tool for studying thin polymer films and complex biomolecular systems at the solution-surface interface" Biomacromolecules 4 (5):1099-1120; KA. Fahnrich, M. Pravda and GG. Guilbault (2002) "Immunochemical detection of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAT-Is)" Analytical Letters 35 (8): 1269-1300; J. Wegener, A Janshoff and C. Steinem (2001) "The quartz crystal microbalance as a novel means to study cell-substrate interactions in situ" Cell Bio-chemistry and Biophysics 34 (1):121-151; CK. O'Sullivan and GG. Guilbault "Commercial quartz crystal microbalances - theory and applications" Biosensors & Bioelectronics 14 (8-9):663-670; CK. O'Sullivan, R. Vaughan and GG. Guilbault (1999) "Piezoelectric immunosensors - theory and applications" Analytical Letters 32 (12):2353-2377; K. Bizet, C. Grabielli and H. Perrot (1999) "Biosensors based on piezoelectric transducers" Analusis EurJAC 27:609-616).

El uso del resonador a cristal de cuarzo en corte AT como microbalanza de cuarzo, más conocida por sus siglas en literatura anglosajona QCM (quartz crystal microbalance), se basa en la bien conocida, por los expertos en la materia, ecuación de Sauerbrey (G. Sauerbrey (1959) "Verwendung von schwingquarzen zur wägung dünner schichten and zur mikrowägung" Zeitschrift Fuer Physik 155 (2): 206-222). La ecuación de Sauerbrey establece que la disminución en la frecuencia de resonancia del resonador es proporcional al incremento en la densidad superficial de masa del recubrimiento sobre la superficie del sensor. Cuando el sensor está en contacto con un medio liquido Newtoniano, la ecuación de Kanazawa (K.K. Kanazawa and J.G. Gordon II (1985) "The oscillation frequency of a quartz resonator in contact with a liquid" Analytica Chimica Acta 175:99-105) proporciona el desplazamiento en la frecuencia de resonancia del resonador debido al contacto con el fluido. Para un sensor QCM con una de sus superficies recubierta por una capa de material muy fina, tan fina que el desfase de la onda acústica a través del espesor del recubrimiento sea muy pequeño, y enfrentada a un medio líquido Newtoniano, la ecuación de Martin (I) proporciona la relación cuantitativa de la combinación de los efectos de la masa del recubrimiento (efecto Sauerbrey) y del líquido (efecto Kanazawa) en la variación de la frecuencia de resonancia (S.J. Martin, V.E. Granstaff and G.C. Frye (1991) "Characterization of quartz crystal microbalance with simultaneous mass and liquid loading" Anal. Chem. 63:2272-2281).

En la ecuación anterior, el primer término del segundo miembro corresponde al efecto Sauerbrey y el segundo al efecto Kanazawa, donde f_s es la frecuencia de resonancia del sensor, Z_cq es la impedancia acústica característica del cuarzo, ρ_c y h_c, son, respectivamente, la densidad y el espesor del recubrimiento y ρ_L y δ_L son, respectivamente, la densidad y la profundidad de penetración de la onda acústica en el líquido: 1/2ρ_Lδ_L es, de hecho, la densidad superficial de masa equivalente asociada con el movimiento oscilante de la superficie del sensor en contacto con el medio líquido.

De acuerdo con la ecuación (I), para una densidad de masa superficial del recubrimiento determinada, el valor absoluto del desplazamiento de frecuencia se incrementa de forma directamente proporcional al cuadrado de la frecuencia de resonancia. Consecuentemente, parece lógico pensar que tanta mayor sensibilidad tendrá un sensor QCM cuanto mayor sea su frecuencia de resonancia. De hecho, la frecuencia de resonancia ha sido siempre el parámetro de caracterización fundamental en los sensores QCM.

Efectivamente, en la práctica, la gran mayoría de las técnicas utilizadas en la caracterización de sensores QCM han sido utilizadas para determinar la variación en la frecuencia de resonancia del resonador, entre otros parámetros relevantes del mismo (la patente US5201215 concedida a Granstaff et al. "Method for simultaneous measurement of mass loading and fluid property changes using a quartz crystal microbalance", incluye otros parámetros del sensor que es conveniente monitorear; ver también las referencias: A. Arnau, V. Ferrari, D. Soares, H. Perrot, "Interface Electronic Systems for AT-Cut QCM Sensors. A comprehensive review", in Piezoelectric Transducers and Applications, 2nd Ed., pp 117, A.Arnau Ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, (2008); F. Eichelbaum, R. Borngräber, J. Schröder, R. Lucklum, and P. Hauptmann (1999) "Interface circuits for quartz crystal microbalance sensors" Rev. Sci. Instrum. 70:2537-2545): los analizadores de redes o de impedancia se utilizan para determinar la conductancia del resonador en el margen de frecuencias de resonancia y determinar la frecuencia que corresponde con la máxima conductancia (J. Schröder, R. Borngräber, R. Lucklum and P. Hauptmann (2001) "Network analysis based interface electronics for quartz crystal microbalance" Review Scientific Instruments 72 (6):2750-2755; S. Doerner, T. Schneider, J. Schröder and P. Hauptmann (2003) "Universal impedance spectrum analyzer for sensor applications" in Proceedings of IEEE Sensors 1, pp. 596-594); la técnica de decaimiento, que está recogida en la patente US6006589 concedida a Rodahl et al., en 1999 (ver también la referencia M. Rodahl and B. Kasemo (1996) "A simple setup to simultaneously measure the resonant frequency and the absolute dissipation factor of a quartz crystal microbalance" Rev. Sci. Instrum. 67:3238-3241), procesa la señal resultante al desconectar la señal con la que ha sido excitado el resonador, durante un cierto...

1. Método para caracterizar la transferencia, acumulación o pérdida de masa sobre un recubrimiento depositado sobre un resonador piezoeléctrico que actúa como sensor, conectado a un circuito al que se le aplica una señal de test, y enfrentado a un medio fluido cuyas características físicas permanecen estables, caracterizado por las operaciones de:

a) Seleccionar la frecuencia de la señal de test sustancialmente igual a la frecuencia de resonancia serie dinámica (FRSD) del resonador en su estado inicial, tomando dicho estado como referencia.

b) Medir los valores de dos señales de tensión, una de las cuales establece la referencia de fase del sensor y la otra la referencia del nivel de pérdidas del mismo.

c) Hacer un seguimiento de los valores de las tensiones tomadas como referencia en el paso anterior durante el proceso que se desea caracterizar o monitorear.

d) Verificar que el valor de la tensión de referencia de pérdidas del sensor no se modifica sustancialmente durante el proceso de medida.

e) Corregir el valor de la frecuencia de la señal de test durante el proceso a monitorear, en caso de que la señal que proporciona la medida de la variación de fase se haya desviado, por encima o por debajo de un valor previamente determinado en función de las características del experimento, del valor de tensión obtenido como referencia de fase del sensor en el paso b), hasta que la señal de tensión que proporciona la medida de la variación de fase vuelva a tener el mismo valor que el obtenido como referencia de fase del sensor en el paso b), o su diferencia en valor absoluto sea menor de una cierta cantidad previamente establecida en función de las características del experimento.

f) Obtener la variación de masa sobre el recubrimiento, durante el proceso experimental que se ha monitoreado, a partir de las variaciones de la señal de tensión que proporciona la medida de la variación de fase, siendo calculada dicha variación de masa como una función de la variación de fase de la señal.

2. Un método para caracterizar la transferencia, acumulación o pérdida de masa sobre un recubrimiento depositado sobre un sensor piezoeléctrico resonante según la reivindicación 1, caracterizado porque la obtención de la variación de la masa sobre el recubrimiento se realiza mediante la aplicación de la siguiente expresión:

3. Un método para caracterizar la transferencia, acumulación o pérdida de masa sobre un recubrimiento depositado sobre un sensor piezoeléctrico, y enfrentado a un medio fluido cuyas características físicas permanecen estables, según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque el paso e) donde se corrige la frecuencia de la señal de test, se realiza de forma continuada proporcionando una corrección en la frecuencia de la señal de test de acuerdo con una determinada función, y en particular de acuerdo a una variación integral o cuasi-integral de las variaciones que se producen en la señal de tensión que proporciona la variación de fase del sensor.

4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el resonador piezoeléctrico es un resonador acústico de película delgada.

5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el resonador piezoeléctrico es un resonador que vibra en modo de cizalla.

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la obtención de la variación de masa establecida en el paso f) es indicativa de la concentración de un determinado material o compuesto químico o biológico en la disolución líquida que está en contacto con el recubrimiento.

7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, aplicado para interrogar simultáneamente a varios sensores piezoeléctricos.

8. Un dispositivo para la detección de cambios de masa que implementa el método de las reivindicaciones 1-6, que comprende:

- un resonador piezoeléctrico integrado como un sensor resonante (2) sobre cuya superficie se ha depositado física o químicamente un material en forma de capa fina;

- un medio fluido en contacto con la capa fina depositada y cuyas propiedades físicas se mantienen sensiblemente constantes durante el proceso químico o físico que tenga lugar;

- una fuente de señal (42) de frecuencia determinada, de gran estabilidad en frecuencia y bajo ruido de fase;

- un subsistema de síntesis de frecuencia (41);

- un subsistema de control y adquisición de señal (40);

- un circuito acondicionador de señal con capacidad de filtrado y adecuación de niveles de potencia, formado por un filtro (43) y un amplificador (44);

- un circuito (45) formado por dos ramas que comparten la entrada (u_i) y tiene dos salidas, (u₁, u₂), una para cada rama, estando una de las ramas compuesta por componentes (25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 34), cuya respuesta de fase-frecuencia no cambia y la otra rama incluye, en parte, los mismos componentes que la primera (25, 26, 28, 30, 31, 32), a modo de espejo, y el sensor resonante (2);

- un subsistema de detección de fase (35) de ganancia ajustable, compuesto por un multiplicador (36) y un filtro paso bajo (37), que proporciona una señal de tensión (u₀) proporcional a la diferencia de fase entre las señales a sus entradas (u₁, u₂); y

- un subsistema de medida de potencia (38) que proporciona una señal de tensión (u_A) proporcional a la diferencia entre los niveles de potencia de las señales a sus entradas (u₁, u₂);

caracterizado porque:

- el subsistema de síntesis de frecuencia (41) proporciona, a partir de la señal de la fuente de frecuencia (42) determinada, una señal cuya frecuencia puede barrer la banda de frecuencias de resonancia del resonador sensor (2);

- la señal proporcionada por el subsistema de síntesis de frecuencia (41) está conectada a la entrada del circuito acondicionador de señal, formado por el filtro (43) y el amplificador (44), que la filtra adecuadamente y le proporciona el nivel de potencia adecuado;

- la salida (u;) del amplificador (44) está conectada a la entrada del circuito (45) de dos ramas donde está conectado el sensor resonante (2);

- cada una de las salidas (u₁, u₂) del circuito (45) de dos ramas, está conectada a una de las entradas del subsistema de detección de fase (35), cuya salida proporciona una señal de tensión continua (u₀) de valor proporcional a la diferencia de fases entre las señales (u₁, u₂) a sus entradas;

- cada una de las salidas (u₁, u₂) del circuito (45) de dos ramas también está conectada a una de las entradas del circuito de medida de potencia (38), cuya salida proporciona una señal de tensión continua (u_A) de valor proporcional a la diferencia de niveles de potencia entre las señales (u₁, u₂) a sus entradas;

- las salidas de los circuitos de detección de fase (35) y de nivel de potencia (38) son adquiridas por el sistema de control (40) que puede actuar sobre el subsistema de síntesis de frecuencia (41) para controlar la frecuencia de la señal de salida de dicho subsistema.

9. Un dispositivo para la detección de cambios de masa que implementa el método de las reivindicaciones 1-6 y que permite la realización de experimentos en flujo con resonadores piezoeléctricos compuesto por:

- una pieza soporte (1) de forma cilíndrica y caras circulares paralelas, sobre la que está depositado el sensor resonante (2);

- un bloque inferior (13) de dimensiones y forma adecuadas, sobre el que está depositada la pieza soporte (1) y conecta los electrodos del sensor resonante (2) a un conector externo (16);

- un bloque superior (17) que está depositado sobre la pieza soporte (1) y que incorpora un conjunto de canales (20) y racores (18) como elementos de canalización de flujo;

caracterizado porque:

- la pieza soporte (1) tiene un agujero (7) que fija su posición sobre el bloque inferior (13) y ha sido mecanizado de tal forma que incluye por su cara circular inferior:

- un hueco central (10) donde está depositado el sensor resonante (2);

- un agujero central (8) pasante que deja accesible la zona central de uno de los electrodos (4) del resonador (2) por la cara circular superior de la pieza soporte (1);

- unas ranuras (5) que parten del hueco central (10) donde se deposita el sensor (2) y se extienden hacia los bordes exteriores de la pieza soporte (1) sin alcanzarlos;

- unos nervios (6) que actúan de muro entre las ranuras y el hueco central (10);

- otro nervio (9) que bordea el agujero central (8) del hueco (10), quedando a la misma altura que los otros nervios (6, 9), de forma que al introducir el sensor (2) en el hueco (10), éste queda depositado sobre todos los nervios (6, 9);

y donde:

- los extremos de los electrodos (4) del sensor resonante (2) alcanzan las ranuras (5) por encima de los nervios (6, 9);

- un material sellante rellena el hueco entre la superficie inferior del sensor y los nervios (6,9);

- un material conductor está depositado a lo largo y ancho de las ranuras (5) y hasta el límite de los nervios (6) que separan las ranuras (5) del hueco central (10), estableciendo contacto eléctrico con los extremos de los electrodos (4) del resonador piezoeléctrico (2);

- el bloque inferior (13) ha sido mecanizado de tal forma que incluye:

- un hueco de forma y profundidad adecuadas donde están depositados la pieza soporte (1) y, sobre dicho soporte, el bloque superior (17),

- al menos dos agujeros sobre el fondo del hueco anterior en cada uno de los cuales hay introducidos dos elementos de contacto (15), cuyos extremos superiores están en contacto con el material conductor depositado sobre las ranuras (5) de la pieza soporte (1) y ceden al realizar una presión sobre ellos, y cuyos extremos inferiores están conectados a un conector bipolar externo (16);

- el bloque superior (17) está depositado sobre la pieza soporte (1) y encajado en el hueco del bloque inferior (13), que le sirve de guía durante el proceso de colocación sobre dicha pieza soporte (1);

y donde:

- una arandela (19) está encajada sobre una ranura (21) mecanizada para tal fin en la cara inferior del bloque superior (17) y presiona sobre la pieza soporte (1), rodeando el agujero central (8) del mismo a través del cual es accesible la zona central de uno los electrodos (4) del resonador piezoeléctrico (2); y

- dos canales tubulares (20) parten de unos racores (18) situados en la parte superior del bloque superior (17) y desembocan en la parte central inferior, dentro de la zona central interior a la arandela (19).

10. Un dispositivo para la detección de cambios de masa que comprende, al menos, un dispositivo según la reivindicación 8, y que implementa el método de la reivindicación 7.