MÉTODO PARA DETERMINAR LA CONCENTRACIÓN DE HEMOGLOBINA TOTAL EN SANGRE COMPLETA, NO DILUIDA Y NO HEMOLIZADA.

Un método para determinar una concentración de hemoglobina total en una muestra de sangre completa,

no diluida y no hemolizada, a partir de los resultados de las mediciones de absorción sobre la muestra, caracterizado por que se realizan dos, y solo dos, mediciones de absorción, en el que una primera de las dos mediciones de absorción sobre la muestra se realiza a una longitud de onda en el intervalo 490-520 nm, y una segunda de las dos mediciones de absorción en la muestra se realiza a una longitud de onda en el intervalo de 650­ 1200 nm, donde la absorción es sustancialmente menor que para la primera medición de absorción, comprendiendo dicho método: procesar los resultados de la primera y segunda mediciones de absorción para determinar la concentración de hemoglobina en la muestra, en el que el paso de procesamiento comprende compensar la dispersión en la muestra, dependiendo dicha compensación del resultado de la segunda medición de absorción

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a un método de análisis para determinar hemoglobina en sangre completa no alterada.

Técnica Antecedente

Una cubeta desechable para muestrear un fluido, mezclar la muestra con un reactivo y realizar directamente análisis ópticos de la muestra mezclada con el reactivo se conoce previamente de la Patente de Estados Unidos Nº 4.088.448. Esta cubeta conocida tiene diversas ventajas, tales como que simplifica el procedimiento de muestreo, reduce el número de utensilios y mejora considerablemente la precisión del análisis, haciendo al procedimiento de análisis independiente de la técnica operativa del operario que realiza el análisis. Una construcción de cubeta basada en el mismo principio y con características de flujo mejoradas se describe en la Patente de Estados Unidos 5 674 457.

Una cubeta desechable, desarrollada de acuerdo con estas patentes, se usa mucho actualmente para la medición de hemoglobina (determinación de Hb) de sangre completa no diluida. Para ello, la cavidad de la cubeta se ha pre-tratado con un reactivo, de manera que cuando una muestra de sangre se pone en la cubeta, las paredes de los glóbulos rojos se desintegran y se inicia una reacción química. El resultado de la reacción permite la determinación de Hb mediante una medición de absorción directamente a través de las paredes transparentes de la cubeta que, en la zona de medición, denominada también ventana óptica, tiene una distancia predeterminada y definida con precisión entre las superficies internas de las paredes planas opuestas. El método de medición está basado en un método de azidmethemoglobina modificado de acuerdo con Vanzetti, G., Am. J. Lab. & Clin. Med. 67, 116 (1966).

Las mediciones espectrofotométricas se realizan a 570 y 880 nm. Este método de medición cuantitativo, basado en química seca, ha alcanzado un éxito considerable como puede verse, por ejemplo, en el artículo de von Schenck et al en Clinical Chemistry, vol 32, No 3, 1986, puesto que el método da resultados iguales o incluso superiores en comparación con los resultados obtenidos con los métodos en húmedo normalizados para la determinación de Hb. El reactivo usado está compuesto por desoxicolato sódico, que hemoliza los glóbulos rojos, azida sódica y nitrito sódico, que convierten la hemoglobina en azidmethemoglobina.

Debido a las propiedades higroscópicas de los reactivos usados, la vida útil está limitada y se requiere el almacenamiento de las cubetas en envases sellados, incluyendo un agente de secado. Es aún más problemático el hecho de que, en climas con alta humedad, la cubeta tenga que usarse unos pocos minutos después de la retirada del envase, puesto que de lo contrario los reactivos se destruirán y la medición será imprecisa y, por tanto, inútil.

Sin embargo, los problemas originados de las propiedades higroscópicas de los reactivos usados, pueden eliminarse, puesto que se ha encontrado que estos reactivos no pueden usarse como se describe en la solicitud de patente en trámite junto con la presente PCT SE01/01442 de acuerdo con la cual la primera medición de absorción se realiza a un intervalo de longitud de onda de 490-520 nm, directamente sobre la muestra en la microcubeta. Sin embargo, de acuerdo con la invención descrita en esta solicitud de patente, es necesario hemolizar la sangre antes de realizar la medición. Por lo tanto, la cavidad de la cubeta debe incluir un agente de hemólisis para disgregar los glóbulos rojos y liberar la hemoglobina contenida en estas células. La necesidad de usar un agente de hemólisis cuando se realizan mediciones de absorbancia fotométrica de hemoglobina en una muestra de sangre también se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos 5 064 282 (Artel).

Se conocen métodos cuantitativos para la determinación óptica de hemoglobina en sangre completa sin usar un agente de hemólisis, aunque estos métodos tienen en común que todos ellos son comparativamente complicados. Esto depende, sobre todo, de la falta de homogeneidad de la sangre, debido a la alta concentración de glóbulos rojos, una consecuencia de lo cual es que la luz se dispersa tras la interacción con estas partículas de las muestras de sangre no homogénea. Por consiguiente, la luz no se transmite directamente a través de la muestra, sino que se desvía en un intervalo de ángulos de dispersión. Otro factor que provoca problemas es el hecho de que la sangre puede contener tantas como cinco especies diferentes de hemoglobina. Las publicaciones de patente que abordan estos problemas son, entre otras, la Patente de Estados Unidos 6 262 798 (Shepherd) y el documento WO 01/53806 (Radiometer).

De acuerdo con la invención descrita en la Patente de Estados Unidos 6 262 798, es necesaria una pluralidad de longitudes de onda para conseguir una medición correcta. El hecho de que se necesiten muchas longitudes de onda hace que el espectrofotómetro sea comparativamente complicado. Las longitudes de onda se seleccionan por su capacidad para distinguir las especies de hemoglobina a una dispersión mínima y una absorbancia máxima. La patente describe también el uso de un gran detector que reduce el problema de la dispersión más allá del intervalo de detección.

El documento WO 01/53806 describe un aparato que es especialmente aplicable para mediciones ópticas en sangre completa. Este aparato comprende un filtro de absorción o un filtro de interferencia, que proporciona corrección para las variaciones en la sensibilidad del detector y en la longitud eficaz de la trayectoria óptica, como se observa tras variar el nivel de dispersión. El aparato usa un gran detector para detectar la luz dispersada transmitida a través del filtro de absorción o el filtro de interferencia.

El hallazgo de acuerdo con la presente invención de que una determinación precisa de la cantidad total de hemoglobina en sangre completa puede hacerse no solo sin usar un agente de hemólisis sino también sin usar una pluralidad de longitudes de onda como se describe en la Patente de Estados Unidos 6 262 798 o un filtro de absorción o interferencia especial que proporcione corrección para las variaciones en la sensibilidad del detector y en la longitud de la trayectoria óptica eficaz, como se observa tras variar el nivel de dispersión como se describe en el documento WO 01/53806, por lo tanto, fue muy inesperado.

Objetos de la Invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método cuantitativo y rápido, para la determinación de hemoglobina en sangre completa no alterada.

Otros objetos resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas.

Sumario de la Invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para determinar una concentración de hemoglobina en una muestra de sangre completa no hemolizada, no diluida, a partir de los resultados de dos, y solo dos, mediciones de absorción, en concreto una primera medición de absorción sobre la muestra realizada a una longitud de onda en el intervalo de 490-520 nm y una segunda medición de absorción sobre la muestra realizada a una longitud de onda en el intervalo de 650-1200 mn. El método comprende: procesar los resultados de la primera y segunda mediciones de absorción para determinar la concentración de hemoglobina en la muestra, en el que el paso de procesamiento comprende compensar la dispersión en la muestra, dependiendo dicha compensación del resultado de la segunda medición de absorción.

Inesperadamente, se ha encontrado que las determinaciones cuantitativas de hemoglobina pueden realizarse fácilmente no solo sin reactivos químicos de azida sódica y nitrito sódico, sino también sin un agente de hemólisis directamente sobre la sangre completa no alterada, es decir, no diluida y no hemolizada. Puesto que la sangre completa no alterada contiene células sanguíneas, hay una dispersión sustancial de la luz en la muestra. De esta manera, hasta ahora se ha esperado que una determinación cuantitativa de hemoglobina en sangre completa no diluida, no hemolizada, requeriría detectar y analizar la luz dispersada. De acuerdo con la invención, la determinación de hemoglobina puede realizarse mediante dos mediciones de absorción, sin necesidad de conocer cuantitativamente los coeficientes de dispersión de los contenidos de la sangre, o reducir físicamente los efectos medidos de la luz dispersada. Inesperadamente, se ha encontrado que compensando el nivel de absorción de la... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar una concentración de hemoglobina total en una muestra de sangre completa, no diluida y no hemolizada, a partir de los resultados de las mediciones de absorción sobre la muestra,

caracterizado por que se realizan dos, y solo dos, mediciones de absorción, en el que una primera de las dos mediciones de absorción sobre la muestra se realiza a una longitud de onda en el intervalo 490-520 nm, y una segunda de las dos mediciones de absorción en la muestra se realiza a una longitud de onda en el intervalo de 6501200 nm, donde la absorción es sustancialmente menor que para la primera medición de absorción, comprendiendo dicho método:

procesar los resultados de la primera y segunda mediciones de absorción para determinar la concentración de hemoglobina en la muestra, en el que el paso de procesamiento comprende compensar la dispersión en la muestra, dependiendo dicha compensación del resultado de la segunda medición de absorción.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho procesamiento determina la concentración de hemoglobina en la muestra calculando la siguiente fórmula:

[Tot Hb] = (Abs1-Abs2) • k + F (Abs2) en la que [Tot Hb] es la concentración total de hemoglobina en la muestra, Abs1 es la absorbancia medida de la primera medición de absorción, Abs2 es la absorbancia medida de la segunda medición de absorción, k es un coeficiente de calibrado, que depende del dispositivo de medición y F(Abs2) es una función que depende de la absorbancia medida de la segunda medición de absorción.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la primera medición de absorción se realiza a 20 una longitud de onda en el intervalo de 500-510 nm, más preferiblemente a 506 nm.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la segunda medición de absorción se realiza a una longitud de onda en el intervalo de 850-910 nm, más preferiblemente en el intervalo de 860-900 nm.