Se describe un procedimiento de producción eficiente de grandes cantidades SS recombinante soluble en su forma activa,

mediante expresión del gen que codifica para la SS en una cepa de Escherichia coli. El vector de expresión utilizado permite que la SS recombinante producida posea una cola de histidinas que facilita su purificación de manera rápida. Asimismo se describen secuencias de versiones mutadas del gen de la SS que codifican para isoformas de la SS adecuadas para la producción de ADPG. Haciendo uso de las versiones "silvestre" y "mutada" de SS recombinante, se describe un método eficiente de producción de ADPG y UDPG. También se describe la utilización de la SS para la producción de dispositivos de ensayo de determinación de sacarosa. Por último se describe la obtención de plantas transgénicas que sobre-expresan el gen de la SS, bien constitutivamente, bien en hojas u órganos de reserva, y que poseen un contenido alto (tanto en hojas como en tejidos de reserva) en sacarosa, ADPG, G6P y almidón como resultado de la alta actividad sintetizadora de ADPG de la SS

SECTOR DE LA TÉCNICA AL QUE SE REFIERE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a la optimización de la producción de sacarosa sintasa recombinante (SS) en forma soluble y activa haciendo uso de una cepa apropiada de Escherichia coli, la utilización de la SS para la elaboración de dispositivos (kits) de determinación de sacarosa, diseño de formas optimizadas de SS para la síntesis de ADPglucosa (ADPG), y a la obtención de plantas transgénicas cuyas hojas y tejidos de reserva acumulan altos niveles de ADPG y almidón enriquecido en amilosa como resultado de la sobreproducción de ADPG citosólico en plantas que sobreexpresan la SS.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El almidón constituye la forma principal de almacenamiento de carbohidratos en plantas. Se acumula en grandes cantidades en órganos tales como semillas (trigo, cebada, maiz, guisante, etc.) y tubérculos (patata y batata entre otros) y es un constituyente fundamental de la dieta del ser humano. Por otro lado, el almidón es utilizado frecuentemente en las industrias papelera, cosmética, farmacéutica y alimentaria, y también se utiliza como componente fundamental para la fabricación de plásticos biodegradables y pinturas de bajo impacto medioambiental. Constituidos por moléculas de glucosa unidas covalentemente, el estudio de los procesos implicados en la síntesis de este polisacárido constituye un tema prioritario en diversos ámbitos de la producción industrial.

El ADPG es el precursor universal de la biosíntesis del almidón en plantas, tanto en órganos heterotróficos (Fig. 1A) como en hojas (Fig. 2A), y está ampliamente asumido que su producción está exclusivamente controlada por el enzima ADPG pirofosforilasa (AGPasa) o ADPG sintasa (EC 2.7.7.27) (Okita, T. W. (1992) Is there an alternative pathway for starch synthesis? Plant Physiol. 100, 560-56; Müller-Róber, B., Sonnewald, U. Willmitzer, L. (1992) Inhibition of the ADP-glucose pyrophosphorylase in transgenic potatoes leads to sugar-storing tubers and influences tuber formation and expression of tuber storage protein genes. EMBO J. 11, 1229-1238; Stark, D.M., Timmerman, K.P., Barry, G.F., Preiss, J., Kishore, G.M. (1992) Regulation of the amount of starch in plant tissues by ADPglucose pyrophosphorylase. Science 258, 287-282; Neuhaus, E.H., Háusler, R.E., Sonnewald, U. (2005) No time to shift the paradigm on the metabolic pathway to transitory starch in leaves. Trends Plant Sci. en prensa). Las diferentes aplicaciones del almidón producido en una planta están basadas principalmente en el balance de amilosa y amilopectina, el cual determina la estructura del granulo de almidón, así como su viscosidad en suspensiones acuosas. Tal proporción de amilosa y amilopectina depende, entre otras razones, de la concentración de ADPG en la célula vegetal (Clarke, B.R., Denyer, K., Jenner, C.F., Smith, A.M. (1999) The relationship between the rate of starch synthesis, the adenosine 5"diphosphoglucose concentration and the amylose content of starch in developing pea embryos. Planta 209, 324-329).

La SS (EC 2.4.1.13, SS) (UDP-glucose:D-fructose-2-glucosyl transferase) es una enzima reversible que cataliza la producción de UDPG y fructosa a partir de la sacarosa y UDP. Aunque, tal y como se ilustra en la Fig. 1A, clásicamente se ha atribuido a la SS el papel de producir el UDPG cuyo procesamiento metabólico é lugar a la producción eventual de almidón en tejidos heterotróficos tales como endospermos y tubérculos (Zrenner, R., Salanoubat, M., Willmitzer, L., Sonnewald, U. (1995) Evidence for the crucial role of sucrose synthase for sink strength using transgenic potato plants. Plant J. 7, 97-107; Baroja-Fernández, E., Muñoz, F.J., Saikusa, T. , Rodriguez-López, M., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2003) Sucrose synthase catalyzes the de novo production of ADPglucose linked to starch biosynthesis in heterotrophic tissues of plants. Plant Cell Physiol. 44, 500-509; Pozueta-Romero, J., Muñoz, F.J., Rodriguez-López, M., Baroja-Fernández, E., Akazawa, T. (agosto 2003) New waves in the starch field. Lett. Plant Cell Physiol. 24-32), existen referencias sobre la potencialidad del enzima de utilizar in vitro otros nucleótidos difosfato para la producción de los correspondientes azúcares-nucleótido (Murata, T., Sugiyama, T., Minamikawa, T., Akazawa, T. (1966) Enzymic mechanism of starch synthesis in ripening rice grains. Mechanism of the sucrose-starch conversion. Arch. Biochem. Biophys. 113, 34-44; Delmer, D. P. (1972) The purification and properties of sucrose synthase from etiolated Phaseolus aureus seedlings. J. Biol. Chem. 247, 3822-3828;). Aunque de cuestionada relevancia fisiológica (Okita, T.

W. (1992) Is there an alternative pathway for starch synthesis? Plant Physiol. 100, 560-56; Müller-Rober, B., Sonnewald, U. Willmitzer, L. (1992) Inhibition of the ADP-glucose pyrophosphorylase in transgenic potatoes leads to sugar-storing tubers and influences tuber formation and expression of tuber storage protein genes. EMBO J. 11, 12291238), se ha sugerido que la SS está capacitada para producir directamente ADPG utilizable para la producción de almidón tanto en tejidos heterotróficos como tejidos fotosintéticos (Figs. 1B y 2B) (Pozueta-Romero, J., Perata, P., Akazawa, T. (1999) Sucrose-starch conversión in heterotrophic tissues of plants. Crit. Rev. Plant Sci. 18, 489-525; Baroja-Fernández, E., Muñoz, F.J., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2001) Reappraisal of the currently prevailing model of starch biosynthesis in photosynthetic tissues: a proposal involving the cytosolic production of ADP-glucose by sucrose synthase and occurrence of cyclic turnover of starch in the chloroplast. Plant Cell Physiol. 42, 1311-1320; Baroja-Fernández, E., Muñoz, F.J., Saikusa, T., Rodriguez-López, M., Akazawa, T. , Pozueta-Romero, J. (2003) Sucrose synthase catalyzes the de novo production of ADPglucose linked to starch biosynthesis in heterotrophic tissues of plants. Plant Cell Physiol. 44, 500-509; Baroja-Fernández, E., Muñoz, F.J., Zandueta-Criado, A., Morán-Zorzano, M.T., Viale, A.M., Alonso-Casajús, N., Pozueta-Romero, J. (2004) Most of ADPglucose linked to starch biosynthesis occurs outside the chloroplast in source leaves. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101, 13080-13085). De acuerdo a esta hipótesis (basada única y circunstancialmente en evidencias de tipo bioquímico), la SS seria responsable de la síntesis de un pool importante de moléculas de ADPG necesarias para la biosíntesis del almidón. Tal hipótesis sin embargo no ha sido demostrada experimentalmente mediante ingeniería genética o técnicas de mejora tradicional de cultivos, y no es consistente con las innumerables pruebas de tipo genético y molecular que indican que la AGPasa es la única fuente de ADPG en plantas (Okita, T. W. (1992) Is there an alternative pathway for starch synthesis? Plant Physiol. 100, 56056; Müller-Róber, B., Sonnewald, U. Willmitzer, L. (1992) Inhibition of the ADP-glucose pyrophosphorylase in transgenic potatoes leads to sugar-storing tubers and influences tuber formation and expression of tuber storage protein genes. EMBO J. 11, 1229-1238; Neuhaus, E.H., Háusler, R.E., Sonnewald, U. (2005) No time to shift the paradigm on the metabolic pathway to transitory starch in leaves. Trends Plant Sci. en prensa).

Azúcares-nucleótidos tales como el UDPG o el ADPG se producen para su comercialización a partir de reacciones pirofosforilásicas catalizadas por enzimas tales como la UDPG pirofosforilasa (UGPasa) y la AGPasa, respectivamente, basadas en la utilización de una sustancia de alto coste económico denominada glucosa-1-fosfato (G1P). Una alternativa a esta práctica de producción de azúcares-nucleótidos se basa en la utilización de SS cuyo desarrollo se ha visto impedido en gran medida por las limitaciones de Escherichia coli para expresar y procesar de manera eficiente un gran número de proteínas eucariotas. Tal limitación ha impulsado a algunos investigadores a producir SS recombinante haciendo uso de factorías biológicas de tipo eucariota tales como las levaduras (Zervosen, A., Rómer, U., Elling L. (1998) Application of recombinant sucrose synthase-large scale synthesis of ADP-glucose. J. Mol. Catalysis B: Enzymatic 5, 25-28; Romer, U., Schrader, H., Günther, N., Nettelstroth, N., Frommer, W.B., Elling, L. (2004) Expression, purification and characterization of recombinant sucrose synthase I from Solanum tuberosum L. For carbohydrate engineering. J. Biotechnology 107, 135-149). Alternativamente, la SS destinada a la producción de azúcaresnucleótidos ha tenido que ser purificada mediante costosos procesos de purificación de proteínas a partir de extractos vegetales... [Seguir leyendo]

1. Sacarosa sintasa caracterizada por la SEQ ID NO: 12.

2. Uso de la sacarosa sintasa de la reivindicación 1 en la producción de ADPG, caracterizado por la incubación de ADP y una isoforma de la sacarosa sintasa de patata, en condiciones adecuadas, seguido del aislamiento y purificación del ADPG producido.

5 3. El uso según la reivindicación 2, caracterizado por que comprende:

a) Incubar durante 12 h a 37ºC 100ml de la siguiente solución:

Sacarosa 1 M HEPES, pH 7.0 50 mM EDTA 1 mM Polietilenglicol 20% MgCl2 1 mM KCl 15 mM ADP 100 mM

b) Detener la reacción mediante calor, preferentemente a 100ºC durante 90 s c) Centrifugar durante 10 min a 10000 g d) Someter a cromatografía en HPLC el sobrenadante, eluyendo y purificando el ADPG, mediante métodos convencionales.

4. Uso de la sacarosa sintasa de la reivindicación 1 en la fabricación de un kit o dispositivo de ensayo para determinación espectofotométrica/fluorimétrica/amperométrica de sacarosa.

25 5. El uso según la reivindicación 4, caracterizado por que comprende el siguiente medio de incubación:

a) 2 unidades de sacarosa sintasa. b) 2 mM de ADP c) 2 unidades de ADPG pirofosfatasa de origen vegetal, animal o microbiano d) 2 unidades de PGM e) 2 unidades de G6PDH f) 0.5 mM de NAD(P) g) 100 ml de tampón de reacción: 50 mM HEPES, pH 7.0/1 mM EDTA/20% polietilenglicol/1 mM

MgCl2/15 mM KCl 35 h) Muestra a ensayar previamente filtrada.

6. El uso según la reivindicación 4, caracterizado por que comprende el siguiente medio de incubación:

a) 2 unidades de sacarosa sintasa.

40 b) 2 mM de UDP c) 2 unidades de UDPG pirofosfatasa de origen vegetal, animal o microbiano d) 2 unidades de PGM e) 2 unidades de G6PDH f) 0.5 mM de NAD(P)

45 g) 100 ml de tampón de reacción: 50 mM HEPES, pH 7.0/1 mM EDTA/20% polietilenglicol/1 mM MgCl2/15 mM KCl h) Muestra a ensayar previamente filtrada.

7. El uso según la reivindicación 4, caracterizado por que comprende el siguiente medio de incubación:

50 a) 2 unidades de sacarosa sintasa. b) 2 mM de UDP c) 2 units de UDPG dehidrogenasa d) 0.5 mM de NAD

55 e) 100 ml de tampón de reacción: 50 mM HEPES, pH 7.0/1 mM EDTA/20% polietilenglicol/1 mM MgCl2/15 mM KCl f) Muestra a ensayar previamente filtrada.

8. Uso de un fragmento de ADN caracterizado por la SEQ ID NO: 11 en la obtención de plantas transgénicas que

60 sobreexpresan sacarosa sintasa, caracterizado por introducir una construcción génica que contenga y exprese el fragmento de ADN de SEQ ID NO: 11 en un vector adecuado y transferir dicha construcción génica al genoma de una planta.

9. Plantas transgénicas caracterizadas por la sobreexpresión de la sacarosa sintasa de la reivindicación 1 y por presentar alto contenido en sacarosa, G6P, ADPG y almidón, respecto a los observados en el mismo tejido u órgano de las correspondientes plantas silvestres, crecidas en idénticas condiciones.

10. Plantas transgénicas, según la reivindicación 9, caracterizadas por que dicha sobreexpresión supone unos niveles de actividad enzimática sacarosa sintasa del orden de 2-10 veces superiores a los existentes en el mismo tejido de una planta silvestre no transgénica.

10 11. Plantas transgénicas, según las reivindicaciones 9 o 10, caracterizadas por que se seleccionan preferentemente entre plantas de tabaco, patata, tomate o arroz.

12. Plantas transgénicas, según la reivindicación 11, donde las hojas tienen un contenido superior en sacarosa,

G6P, ADPG y almidón, y un balance amilosa/amilopectina superior, al observado en las hojas de las 15 correspondientes plantas silvestres.

13. Plantas transgénicas, según la reivindicación 11, cuyas raíces, tubérculos y/o semillas presentan un contenido superior en G6P, ADPG y almidón, y un balance amilosa/amilopectina superior, a los observados en los mismos tejidos u órganos de las correspondientes plantas silvestres.