Procedimiento de producción de etanol a partir de materiales celulósicos o lignocelulósicos que comprende etapas de pretratamiento de un sustrato celulósico o lignocelulósico,

de hidrólisis enzimática del sustrato pretratado y a continuación de fermentación alcohólica del hidrolizado obtenido, en el que se utiliza para producir las enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas, una cepa fúngica modificada genéticamente que pertenece al género Trichoderma y que sobreexpresa la lisozima.

Complementación del secretoma de trichoderma reesei que limita las contaminaciones microbiológicas en el marco de la producción de etanol mediante fermentación

Campo de la invención

La presente invención se inscribe en el marco de un procedimiento llamado de "segunda generación" de producción de etanol a partir de biomasa lignocelulósica, que comprende etapas de pretratamiento de un sustrato celulósico o lignocelulósico, de hidrólisis enzimática del sustrato pretratado y después de fermentación alcohólica del hidrolizado obtenido.

Estudio de la técnica anterior

La biomasa lignocelulósica representa uno de los recursos renovables más abundantes en la tierra, y ciertamente uno de los menos costosos. Los sustratos considerados son muy variados, ya que se refieren a la vez a los sustratos leñosos (frondosos y resinosos) , los sub-productos de la agricultura (paja) o los de las industrias generadoras de residuos lignocelulósicos (industrias agroalimentarias, papeleras) .

La biomasa lignocelulósica está compuesta por tres polímeros principales: celulosa (del 35 al 50%) , hemicelulosa (del 20 al 30%) que es un polisacárido esencialmente constituido por pentosas y por hexosas y lignina (del 15 al 25%) que es un polímero de estructura compleja y de alto peso molecular, compuesto por alcoholes aromáticos unidos por enlaces éter.

Estas diferentes moléculas son responsables de las propiedades intrínsecas de la pared vegetal y se organizan en un entramado complejo.

La celulosa y eventualmente las hemicelulosas son las dianas de la hidrólisis enzimática pero no son directamenteaccesibles a las enzimas. Ésta es la razón por la cual estos sustratos deben experimentar un pretratamiento que precede a la etapa de hidrólisis enzimática. El pretratamiento pretende modificar las propiedades físicas y fisicoquímicas del material lignocelulósico, con la intención de mejorar la accesibilidad de la celulosa pegada a la matriz de lignina y de hemicelulosa. Éste también puede liberar los azúcares contenidos en las hemicelulosas en forma de monómeros, esencialmente pentosas, como xilosa y arabinosa, y hexosas, como galactosa, manosa y glucosa.

El pretratamiento debe, en caso ideal, ser rápido y eficaz, con fuertes concentraciones de sustratos, y las pérdidas de materia deben ser mínimas. Existen numerosas tecnologías: pueden mencionarse las cocciones ácidas, las cocciones alcalinas, la explosión al vapor (Pourquié, J. y Vandecasteele, J.P. (1993) “Conversion de la biomasse lignocellulosique par hydrolyse enzymatique et fermentation”. Biotechnologie, 4ª edición, René Scriban, coordinador de Lavoisier TEC & DOC, París, 677-700.) , los procedimientos Organosolv, o también las tecnologías de doble tornillo que combinan acciones térmica, mecánica y química (Ogier J. C. et al. (1999) “Production d'éthanol à partir de biomasse lignocellulosique” Oil & Gas Science and Technology 54: 67-94) . La eficacia del pretratamiento se mide mediante la susceptibilidad a la hidrólisis del residuo celulósico y la tasa de recuperación de las hemicelulosas. Desde un punto de vista económico, parece preferible que el pretratamiento conduzca a una hidrólisis total de las hemicelulosas, para recuperar las pentosas y eventualmente valorizarlas por separado de la fracción celulósica. Los pretratamientos ácidos en condiciones suaves y mediante explosión al vapor están bien adaptados. Estos permiten una recuperación importante de los azúcares procedentes de las hemicelulosas y una buena accesibilidad de la celulosa a la hidrólisis.

El residuo celulósico obtenido se hidroliza por vía enzimática mediante la utilización de enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas. Microorganismos, como los hongos que pertenecen a los géneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium o Schizophyllum, o las bacterias anaerobias que pertenecen, por ejemplo, al género Clostridium, producen estas enzimas, que contienen particularmente celulasas y hemicelulasas, adaptadas a la hidrólisis total de la celulosa y de las hemicelulosas.

La hidrólisis enzimática se realiza en condiciones suaves (temperatura del orden de 45-50ºC y pH de 4, 8) y es eficaz. Por el contrario, en términos de procedimiento, el coste de las enzimas sigue siendo muy elevado. Debido a esto, se han realizado muchos trabajos para reducir este coste: i) en primer lugar, aumento de la producción de enzimas, seleccionando cepas hiperproductoras y mejorando los procedimientos de fermentación, ii) a continuación, disminución de la cantidad de enzimas en hidrólisis, optimizando la fase de pretratamiento o mejorando la actividad específica de estas enzimas. Durante el último decenio, los principales trabajos se han vinculado a la comprensión de los mecanismos de acción de las celulasas y de expresión de las enzimas para hacer excretar el complejo enzimático más apropiado para la hidrólisis de los sustratos lignocelulósicos, modificando las cepas con las herramientas de biología molecular.

Los hongos filamentosos, como organismos celulolíticos, presentan un gran interés para los industriales ya que tienen la capacidad de producir enzimas extracelulares en una cantidad muy grande. El microorganismo más utilizado para la producción de celulasas es el hongo Trichoderma reesei. Las cepas silvestres tienen la facultad de producir, en presencia de un sustrato inductor, por ejemplo celulosa, un secretoma (conjunto de las proteínas secretadas) adaptado a la hidrólisis de la celulosa. Las enzimas del complejo enzimático contienen tres grandes tipos de actividades: endoglucanasas, exoglucanasas y β-glucosidasas. Otras proteínas que poseen propiedades indispensables para las hidrólisis de los materiales lignocelulósicos también son producidas por Trichoderma reesei, por ejemplo xilanasas. La presencia de un sustrato inductor es indispensable para la expresión de las enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas. La naturaleza del sustrato carbonado tiene una fuerte influencia sobre la composición del complejo enzimático. Éste es el caso de la xilosa que, asociada a un sustrato carbonado inductor como la celulosa o la lactosa, permite mejorar significativamente la actividad llamada xilanasa.

Las técnicas de genética convencional mediante mutagénesis permitieron la selección de cepas de Trichoderma reesei hiperproductoras de celulasas tales como las cepas MCG77 (Gallo -patente US 4275 167) , MCG 80 (Allen, A.L. y Andreotti, R.E., Biotechnol-Bioengi 1982, 12, 451-459 1982) , RUT C30 (Montenecourt, B.S. y Eveleigh, D.E., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782) y CL847 (Durand et al, 1984, Proc. Colloque SFM “Génétique des microorganismes industriels”. París. H. HESLOT Ed, págs. 39-50) . Las mejoras permitieron obtener cepas hiperproductoras, menos sensibles a la represión catabólica en azúcares particularmente monómeros, por ejemplo glucosa, que las cepas silvestres.

La trivialización de las técnicas genéticas, que pretenden expresar genes heterólogos en estas cepas fúngicas, ha abierto también el camino hacia la utilización de estos microorganismos como huéspedes para la producción industrial. Las nuevas técnicas de estudios de los perfiles enzimáticos, han hecho posible la creación de cepas fúngicas huéspedes muy eficaces para la producción de enzimas recombinantes a escala industrial [Nevalainen, H. y Teo, V.J.S. (2003) Enzyme production in industrial fungi-molecular genetic strategies for integrated strain improvement. En Applied Mycology and Biotechnology (Vol. 3) Fungal Genomics (Arora, D.K. y Kchachatourians, G.G., eds) , págs. 241-259, Elsevier Science]. Uno de los ejemplos de este tipo de modificaciones es la producción de celulasas obtenidas de una cepa de T. reesei [Harkki, A. et al. (1991) Genetic engineering of Trichoderma to produce strains with novel cellulase profiles. Enzyme Microb. Technol. 13, 227-233; Karhunen, T. et al. (1993) High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei. I. Endoglucanase I overproduction. Mol. Gen. Genet. 241, 515-522].

Los azúcares obtenidos mediante hidrólisis de la biomasa lignocelulósica son pentosas (xilosa y arabinosa principalmente) , disacáridos (celobiosa) y glucosa. Este último es fácilmente transformado en etanol por la levadura S. cerevisiae utilizada por el conjunto de las industrias de la fermentación alcohólica. Actualmente, ningún otro microorganismo alcanza sus prestaciones en glucosa en condiciones no estériles, es decir un rendimiento del orden de 0, 47 g de etanol por gramo de glucosa, una productividad... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de producción de etanol a partir de materiales celulósicos o lignocelulósicos que comprende etapas de pretratamiento de un sustrato celulósico o lignocelulósico, de hidrólisis enzimática del sustrato pretratado y a continuación de fermentación alcohólica del hidrolizado obtenido, en el que se utiliza para producir las enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas, una cepa fúngica modificada genéticamente que pertenece al género Trichoderma y que sobreexpresa la lisozima.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cepa fúngica pertenece a la especie Trichoderma reesei.

3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en el que los materiales celulósicos o lignocelulósicos se seleccionan entre paja, madera, cultivos forestales, residuos de plantas alcoholígenas, azucareras y cerealeras, residuos de la industria papelera y productos de transformaciones de los materiales celulósicos y lignocelulósicos.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de hidrólisis enzimática tiene lugar a una temperatura comprendida entre 40 y 60ºC y a un pH que varía entre 4 y 5, 5.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en el que a la etapa de hidrólisis enzimática le sigue una etapa de fermentación etanólica.

6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la etapa de hidrólisis enzimática y la fermentación etanólica se realizan simultáneamente.