El uso de un glucano que comprende 15 - 26% de AGU con enlace a(1,

3), 30 - 50% de AGU con enlace a(1,6), y 5 - 20% de AGU con enlace a-(1,3,6), como un agente anticorrosivo

Usos de un glucano derivado de bacterias ácido lácticas como agente contra la corrosión.

La presente invención está en el campo de las biomoléculas enzimáticamente producidas. La invención está particularmente relacionada con el uso de glucanos derivados de bacterias ácido lácticas.

Antecedentes de la invención

Se sabe que diferentes bacterias producen exopolisacáridos, es decir polisacáridos secretados en el medio de cultivo. Los ejemplos bien conocidos de exopolisacáridos bacterianos incluyen xantano de Xanthomonas campestris, gellan de Sphingomonas paucimobilis y pullulan de Aureobasidium pullulans. Las bacterias ácido lácticas que se sabe que producen exopolisacáridos incluyen a las cepas Leuconostoc mesenteroides que producen dextranos, poliglucosa anhidra con enlaces a(1rightarrow6), y alternanos, es decir poliglucosas anhidras que tienen enlaces alternantes a(1rightarrow6) y a(1rightarrow3), cepas de Estreptococo oral que producen glucanos responsables de la formación de placa dental, y una cepa particular de Lactobacillus reuteri que produce glucosa anhidra con enlaces a(1,6)- y a(1,4) (Van Geel-Schutten, y colaboradores., Appl. Environ. Microbiol. (1999) 65, 3008 - 3014). Las propiedades de los exopolisacáridos dependen del tipo de unidades de monosacárido, del tipo de enlaces, del grado y tipo de ramificaciones, la longitud de la cadena del polisacárido, el peso molecular y la conformación de los polímeros.

Argiiello-Morales y colaboradores. (FEMS Microbiol. Lett. 182 (2000) 81 - 85) describen una alternanosucrasa del Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1355. Monchois y colaboradores. (Gene 182 (1996) 23 - 32; FEMS Microbiol. Lett. 159 (1998) 307 - 315) describen por ejemplo dos diferentes dextranosucrasas del Lc. mesenteroides NRRL B-1299. Un método para seleccionar cepas de Leuconostoc mesenteroides que producen una alta proporción de alternano con relación a dextrano es descrito en la patente estadounidense No. 5.789.209. El estado del arte no divulga o sugiere otras bacterias ácido lácticas diferentes a Leuconostoc o Estreptococos que sean capaces de producir glucanos que tengan enlaces tanto a(1rightarrow6) como a(1rightarrow3).

Se encontró que diferentes cepas de bacterias ácido lácticas eran capaces de producir una clase particular de glucanos. Estos glucanos tienen en común que sus unidades de glucosa anhidra (AGU) están enlazadas con enlaces glucosídicos a(1,3) y/o a(1,6), es decir son a-glucanos en gran parte o completamente desprovistos de enlaces a(1,4). Estos glucanos pueden ser de tipo alternano (enlaces alternantes a (1,3) y a(1,6)), mutano (mezclados a(1,3) y a(1,6), usualmente predominando a(1,3)) o dextrano (principalmente enlaces a(1,6), algunos a(1,3)), o de otro tipo. Los glucanos pueden ser producidos a partir de sacarosa, utilizando enzimas sucrasa que son activas en la bacteria ácido láctica. Pueden ser producidos a gran escala y aislados en una forma comercialmente factible, ya que los glucanos son producidos fuera de la célula bacteriana, o incluso en ausencia de la bacteria, utilizando enzimas aisladas de sacarosa. Los glucanos son producidos por cepas de grado alimenticio y tienen interesantes propiedades, tales como utilidad prebiótica o espesante de composiciones en base acuosa.

La invención está relacionada con el uso de glucanos específicos como anticorrosivos.

Descripción de la invención

Las cepas de Lactobacillus que contienen una glucosiltransferasa (glucanosucrasa) capaz de producir un glucano que tiene al menos 10 unidades de glucosa anhidra (AGU) que tiene una columna vertebral que consiste esencialmente de AGU con enlaces a(1,3) y/o a(1,6), en presencia de sacarosa pueden encontrarse entre las fuentes actuales de Lactobacilli, tales como fuentes alimenticias, ensilaje, muestras de mamíferos, etc. Estas cepas que contienen las glucosiltransferasas y que producen los glucanos pueden ser identificadas por aislamiento de cepas de Lactobacillus a partir de estas fuentes, cultivándolas sobre sacarosa y analizando el producto polisacárido utilizando métodos analíticos adecuados tales como cromatografía. Los genes que codifican estas glucosiltransferasas pueden ser identificados por medio de amplificación de fragmentos de secuencias de nucleótidos de la cepa utilizando iniciadores con base en genes conocidos para glucosiltransferasa y reteniendo las cepas positivas (ver los ejemplos). Se aislaron e identificaron diferentes cepas que producen glucano a partir de diferentes fuentes y diferentes especies de Lactobacillus, tales como Lb. reuteri, Lb. fermentum, Lb. sake y Lb. parabuechneri o especies relacionadas. Se identificaron también las gluco- siltransferasas de estas cepas que producen glucano y, se las secuenció parcial o completamente (ver los Ejemplos).

Los nuevos glucanos pueden ser producidos por medio de la actividad de la glucosiltransferasa (glucanosucrasa) de una bacteria ácido láctica sobre un sustrato donante de sacarosa. Los glucanos tienen un peso molecular promedio entre 10 kDa y 1 GDa, y consisten esencialmente de unidades de glucosa anhidra con enlaces a(1,3) y/o a(1,6) (AGU), a las cuales pueden estar unidas cadenas laterales que consisten también de AGU con enlaces a(1,3) y/o a(1,6).

En particular, los glucanos contienen ya sea 15 - 80% de AGU con enlaces a(1,3), 2 - 80%, especialmente 4 - 80% y más especialmente 15 - 80% de AGU con enlaces a(1,6) y 2 - 25% de AGU (ramificación) con enlaces a-(1,3,6), o 80 - 99% de AGU con enlaces a(1,6) y 1 - 20% de AGU (ramificación) con enlaces a(1,3) o a(1,3,6), en particular 1 - 15% de AGU con enlaces a(1,3) y 5 - 15% de unidades con enlaces a(1,3) y a(1,3,6) tomadas en conjunto. La invención se relaciona con el uso de un glucano que tiene un peso molecular promedio de 10 kDa - 50 MDa y que contiene 15 - 26% de AGU con enlaces a(1,3), 30 - 50% de AGU con enlaces a(1,6), 5 - 20% de AGU con enlaces a(1,3,6) y 5 - 35% de AGU terminales.

Las enzimas que se originan en bacterias ácido lácticas, o de fuentes recombinantes, capaces de producir los glucanos descritos anteriormente partiendo de sacarosa pueden ser clasificadas como glucanosucrasas o glucosiltransferasas. Se da información más completa de las secuencias en las SEQ ID Nos 11 y 12.

Se pueden utilizar las enzimas como tales para la producción de los glucanos descritos anteriormente, o para la producción de oligosacáridos y polisacáridos que tienen una estructura similar a la del glucano con enlaces a(1,3) y/o a(1,6). Sus genes pueden ser incorporados también en organismos huésped adecuados, para producir sistemas alternativos de producción de glucano. Tales microorganismos recombinantes, preferiblemente grado alimenticio, por ejemplo bacterias, especialmente bacterias ácido lácticas, levaduras, hongos, etc., que contienen los genes de las glucanosucrasas descritas anteriormente son capaces de expresar las glucanosucrasas.

Este glucano puede ser producido por una cepa de Lactobacillus como se describió anteriormente, o por medio de un microorganismo recombinante que expresa la glucosiltransferasa o por medio de una glucosiltransferasa aislada y una fuente adecuada de glucosa tal como por ejemplo sacarosa. La glucosiltransferasa puede ser aislada por medios convencionales a partir del cultivo de una bacteria ácido láctica positiva para glucosiltransferasa, especialmente una especie de Lactobacillus, o a partir de un organismo recombinante que expresa al gen para la glucosiltransferasa.

El glucano y los glucooligosacáridos producidos por las cepas de Lactobacillus pueden ser recuperados del sobrenadante del cultivo de cepas de Lactobacillus descritas anteriormente, que contienen la glucosiltransferasa. El glucano puede incluir al menos 20, hasta aproximadamente 100.000 unidades a de glucosa anhidra con la estructura única descrita anteriormente.

Las enzimas que producen glucano, o al menos las más preferidas, son constitutivas en las cepas de Lactobacillus, ya que siempre están presentes. Esto es contrario a la mayoría de las cepas de Leuconostoc que producen glucano (dextrano) del estado del arte, en donde las enzimas se expresan únicamente sobre el crecimiento en presencia de sacarosa. Esto permite una producción más eficiente de glucanos por parte de los microorganismos.

Los glucanos de la invención son útiles como agentes anticorrosión, por ejemplo para la protección de cascos de buques. Para ese propósito, se pueden aplicar en forma de soluciones...

1. El uso de un glucano que comprende 15 - 26% de AGU con enlace a(1,3), 30 - 50% de AGU con enlace a(1,6), y 5 - 20% de AGU con enlace a-(1,3,6), como un agente anticorrosivo.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el glucano tiene un peso molecular promedio entre 10 kDa y 50 MDa.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el glucano puede ser producido por medio de la actividad de la glucosiltransferasa de la cepa 180 de Lactobacillus reuteri depositada como LMG P-18389.