Método de recombinación de ácidos nucleicos homólogos, comprendiendo el método:

(i)alinear secuencias homólogas de ácidos nucleicos diana utilizando un programa informático para seleccionar las regiones conservadas de identidad de secuencia y las regiones de diversidad de secuencia,

(ii)sintetizar un conjunto de oligonucleótidos solapantes de trasposición génica familiar, en donde el conjunto de oligonucleótidos corresponde a por lo menos una región de diversidad de secuencia en los ácidos nucleicos diana, y en donde el conjunto de oligonucleótidos colectivamente corresponde a 50% o más de la longitud completa de cada uno de los ácidos nucleicos diana homólogos,

(iii)hibridar el conjunto de oligonucleótidos de trasposición génica familiar,

(iv)elongar el conjunto de oligonucleótidos de trasposición génica familiar utilizando una polimerasa, proporcionando de esta manera una población de ácidos nucleicos recombinados,

(v)desnaturalizar la población de ácidos nucleicos recombinados, proporcionando de esta manera ácidos nucleicos recombinados desnaturalizados,

(vi)hibridar nuevamente los ácidos nucleicos desnaturalizados,

(vii)extender los ácidos nucleicos recombinados y nuevamente hibridados que resultan utilizando una polimerasa,

(viii)repetir las etapas (v) a (vii) por lo menos una vez, y

(iv)seleccionar uno o más de los ácidos nucleicos recombinados y nuevamente hibridados que resultan para un carácter o propiedad deseado, en donde se utilizan proporciones no equimolares de oligonucleótidos de trasposición familiar para sesgar la recombinación

Recombinación de ácidos nucleicos mediada por oligonucleótidos.

Antecedentes de la invención

La trasposición de secuencias de ADN ha proporcionado un cambio de paradigma en la generación, manipulación y selección de ácidos nucleicos recombinantes. Los inventores y sus colaboradores han desarrollado metodologías de evolución artificial rápida para generar genes industriales, agrícolas y terapéuticos, y proteínas codificadas por los mismos, mejorados. Estos métodos, y composiciones relacionadas y un aparato para la práctica de estos métodos representan un trabajo pionero de los inventores y colaboradores.

Varias publicaciones de los inventores y sus colaboradores describen la trasposición de secuencias de ADN. Por ejemplo, Stemmer et al., "Rapid Evolution of a Protein", Nature 370:389-391, 1994; Stemmer, "DNA Shuffling by Random Fragmentation and Reassembly: in vitro Recombination for Molecular Evolution", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751, 1994; Stemmer, patente US nº 5.603.793, titulada "Methods for in vitro recombination"; Stemmer et al., patente US nº 5.830.721, titulada "DNA mutagenesis by random fragmentation and reassembly"; Stemmer et al., patente US nº 5.811.238, titulada "Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination", describe, por ejemplo, la trasposición in vitro e in vivo de ácidos nucleicos, ADN y proteínas, en una diversidad de formatos, por ejemplo mediante ciclos repetidos de mutagénesis, trasposición de secuencias y selección, así como métodos para generar bibliotecas de péptidos y anticuerpos expresados.

Los inventores y sus colaboradores también han desarrollado aplicaciones de la tecnología de trasposición de secuencias de ADN. Además de las publicaciones indicadas anteriormente, Minshull et al., patente US nº 5.837.458, titulada "Methods and compositions for cellular and metabolic engineering" proporciona, por ejemplo, la evolución de rutas metabólicas y la potenciación del bioprocesamiento mediante técnicas de trasposición recursiva de secuencias. Crameri et al., "Construction And Evolution Of Antibody-Phage Libraries By DNA Shuffling", Nature Medicine 2(1):100-103, 1996, describen, por ejemplo, la traposición de anticuerpos para bibliotecas fágicas de anticuerpos. Pueden encontrarse detalles adicionales sobre la trasposición de secuencias de ADN en las patentes WO nº 95/22625, nº 97/20078, nº 96/33207, nº 97/33957, nº 98/27230, nº 97/35966, nº 98/31837, nº 98/13487, nº 98/13485 y nº 98/42832, así como varias otras publicaciones de los inventores y sus colaboradores.

Varias publicaciones de los inventores y sus colaboradores, así como de otros investigadores de la técnica también describen técnicas que facilitan la trasposición de ADN, por ejemplo que permiten el reensamblaje de genes a partir de fragmentos pequeños, o incluso de oligonucleótidos. Por ejemplo, además de las publicaciones anteriormente indicadas, Stemmer et al., la patente US nº 5.834.252, titulada "End complementary polymerase reaction", 1998, describe procedimientos paar amplificación y detectar una secuencia diana (por ejemplo en una mezcla de ácidos nucleicos), así como para ensamblar grandes polinucleótidos a partir de fragmentos de ácidos nucleicos.

Una revisión de las publicaciones anteriormente indicadas revela que la evolución forzada mediante trasposición génica es una importante técnica nueva con muchas aplicaciones prácticas y potentes. De esta manera, resultan altamente deseables nuevas técnicas que faciliten la trasposición génica. La presente invención proporciona nuevos protocolos significativos de trasposición génica, así como muchas otras características que resultarán evidentes tras la revisión completa de la presente exposición.

Descripción resumida de la invención

La invención proporciona un método de recombinación de ácidos nucleicos homólogos, comprendiendo el método:

en donde se utilizan proporciones no equimolares de oligonucleótidos de trasposición familiar para sesgar la recombinación.

Se proporcionan otros aspectos de la invención en las reivindicaciones adjuntas.

Descripción resumida de la exposición

Se dan a conocer en la presente memoria la trasposición de ácidos nucleicos asistida por oligonucleótidos. Estos enfoques asistidos por oligonucleótidos facilitan particularmente los procedimientos de trasposición génica familiar, proporcionando protocolos de trasposición sustancialmente simplificados que pueden utilizarse para producir ácidos nucleicos de trasposición familiar sin aislar ni clonar los ácidos nucleicos homólogos de longitud completa. Además, los enfoques asistidos por oligonucleótidos incluso pueden extenderse a ácidos nucleicos de trasposición no homólogos, accediendo de esta manera a un mayor espacio de secuencia en las moléculas recombinantes resultantes y, de esta manera, a una mayor diversidad molecular. Las técnicas también pueden combinarse con protocolos clásicos de trasposición de ADN, tales como los métodos mediados por ADNasa, o con otros procedimientos de generación de diversidad, tales como la mutagénesis clásica, para incrementar la versatilidad y rendimiento de estos métodos.

Se dan a conocer varios métodos que resultan aplicables a procedimientos de trasposición familiar. En los métodos reivindicados, se hibridan y elongan conjuntos de oligonucleótidos solapantes de trasposición génica familiar, proporcionando una población de ácidos nucleicos recombinados que pueden seleccionarse para un carácter o propiedad deseada. Típicamente el conjunto de oligonucleótidos solapantes de trasposición génica familiar incluye una pluralidad de tipos de oligonucleótido-miembro que presentan subsecuencias de región de consenso derivadas de una pluralidad de ácidos nucleicos diana homólogos. Los conjuntos de oligos opcionalmente proporcionan otras características distintivas, incluyendo la capacidad de entrecruzamiento, la modificación o la selección de codones, y similares.

La población de ácidos nucleicos recombinados puede desnaturalizarse e hibridarse nuevamente, proporcionando ácidos nucleicos recombinados desnaturalizados que después pueden hibridarse nuevamente. Los ácidos nucleicos recombinante resultantes también pueden seleccionarse. Cualquiera o la totalidad de dichas etapas puede repetirse reiteradamente, permitiendo múltiples sucesos de recombinación y selección para producir un ácido nucleico con un carácter o propiedad deseada.

En un aspecto relacionado de la exposición, los métodos para introducir diversidad de ácidos nucleicos familiar durante...

1. Método de recombinación de ácidos nucleicos homólogos, comprendiendo el método:

2. Método según la reivindicación 1, en el que el conjunto de oligonucleótidos de trasposición génica familiar corresponde colectivamente a 60% o más de la longitud completa de los ácidos nucleicos diana homólogos.

3. Método según la reivindicación 1, en el que el conjunto de oligonucleótidos de trasposición génica familiar corresponde colectivamente a 70% o más de la longitud completa de cada uno de los ácidos nucleicos diana homólogos.

4. Método según la reivindicación 1, en el que el conjunto de oligonucleótidos de trasposición génica familiar corresponde colectivamente a 80% o más de la longitud completa de cada uno de los ácidos nucleicos diana homólogos.

5. Método según la reivindicación 1, que es un método para producir ácidos nucleicos de trasposición familiar sin aislamiento ni clonación de los ácidos nucleicos diana homólogos de longitud completa.

6. Método según la reivindicación 1, en el que el conjunto de oligonucleótidos de trasposición génica familiar se sintetiza químicamente según el método de fase sólida de fosforamidita triéster.

7. Método según la reivindicación 1, en el que el conjunto de oligonucleótidos de trasposición familiar comprende una pluralidad de oligonucleótidos de codones modificados.