Una formulación de sensor para monitorizar simultáneamente al menos dos componentes de una composición de gases,

que comprende:

pentahidrato de dicloruro de tris(4,7-difenil-1,10-fenantrolina)rutenio como primer fluoróforo y el colorante yoduro de 1,1'',3,3,3'',3''-hexametilindoldicarbocianina como segundo fluoróforo; un colorante cromóforo indicador ácido-base seleccionado de rojo cresol y azul brometilol; y

una matriz de polímero,

en donde dicho colorante cromóforo y dichos al menos dos fluoróforos se mezclan dentro de dicha matriz de polímero antes de la polimerización de dicha matriz, comprendiendo además dicha formulación de sensor dos polvos de sílice diferentes, siendo dichos dos polvos de sílice un primer polvo de sílice y un segundo polvo de sílice: teniendo dicho primer polvo de sílice una mayor densidad en comparación con el segundo polvo de sílice de menor densidad, estando dicho fluoróforo revestido sobre gránulos de dicho primer polvo de sílice y estando dicho segundo fluoróforo revestido sobre dicho segundo polvo de sílice

Formulación de sensor para la detección de una composición gaseosa y método para detectar la presencia de organismos que respiran.

Fundamento de la invención

Los microorganismos ocupan nuestro ambiente afectando a nuestras vidas tanto de un modo beneficioso como perjudicial. Por esta razón ha habido una necesidad siempre creciente de proporcionar un mecanismo rápido, eficaz y sensible para la detección, identificación y estudio de la presencia y actividad metabólica de los microorganismos.

En los últimos años la ciencia de la microbiología ha experimentado avances considerables. Esto es particularmente cierto para el campo de los sensores usados en la detección, identificación y análisis del comportamiento de los microorganismos. Aunque se han logrados progresos en el campo de la monitorización de los microorganismos, aún persisten ineficacias en los métodos de monitorización usados comúnmente. Por ejemplo, un método lento pero eficaz para analizar la susceptibilidad antimicrobiana, el método del disco de Bauer-Kirby, todavía se usa en los ambientes hospitalarios. Este método emplea la presencia o ausencia de crecimiento visible de los microorganismos para indicar la eficacia de un compuesto antimicrobiano, y generalmente requiere un período de incubación de 18 a 24 horas para permitir el crecimiento del microorganismo antes de que pueda obtenerse un resultado.

Otro método popular para analizar la susceptibilidad antimicrobiana es el método de microdilución de caldo, tal como el sistema Sceptor RTM para analizar la identificación y susceptibilidad antimicrobiana de organismos (Becton Dickinson Diagnostic Instrumentation Systems, Sparks, Md.). Dicho sistema usa un panel de plástico desechable que tiene una pluralidad de cavidades (de aproximadamente 0,4 ml por cavidad cada una de las cuales contiene un compuesto de ensayo diferente o una concentración diferente de un compuesto de ensayo secado sobre la superficie de la cavidad. El organismo que ha de ser analizado se suspende en el medio de ensayo deseado, y se suministran partes alícuotas a las cavidades individuales del panel de ensayo. El reactivo secado en el panel se disuelve en la muestra, y el sistema se incuba durante una noche (18 a 24 horas) para permitir un tiempo suficiente para que los organismos interactúen con el reactivo y para que aparezca un crecimiento visible. El panel se examina luego visualmente en cuanto a la presencia o ausencia de crecimiento, obteniéndose con ello información sobre la susceptibilidad del organismo que se analiza. Pocillos adicionales ayudan a identificar el organismo. Sin embargo, este método de ensayo, al igual que el método del disco de Bauer-Kirby, adolece del inconveniente de que también requieren un largo periodo de incubación.

En los últimos años se han hechos esfuerzos para evitar los largos tiempos de incubación requeridos por los métodos de monitorización antes comentados. Estas innovaciones se han enfocado en la monitorización de la actividad metabólica de los microorganismos en lugar de la monitorización del crecimiento de las colonias. Se han descrito muchos métodos para monitorizar la actividad metabólica de los microorganismos en un intento de monitorizar rápida y precisamente dicha actividad metabólica.

Una innovación en el campo de la monitorización de microorganismos es un aparato, que usa medios ópticos del dispersión de la luz para determinar la susceptibilidad sondando el cambio de tamaño o número de microorganismos en presencia de diversos compuestos antimicrobianos. Un ejemplo de un instrumento comercial, que emplea esta metodología es el constituido por el sistema Vitech (BioMerieux Corp.). En el mejor de los casos este sistema proporcionará información sobre la susceptibilidad antimicrobiana de microorganismos dentro de un periodo de 6 horas para muchos organismos y combinaciones de fármacos. Otras combinaciones pueden requerir tanto como 18 horas antes de que pueda determinarse la susceptibilidad antimicrobiana del organismo por el método del sistema Vitech.

En un esfuerzo por mejorar el método de Bauer-Kirby, se han desarrollado modificaciones que permiten que ciertas muestras sean leídas en cuatro a seis horas. Sin embargo, este sistema modificado es de naturaleza destructiva, requiriendo la pulverización de una solución de revelado de un colorante formador de color sobre la placa de ensayo. El efecto destructivo de la solución de revelado prohíbe la re-incubación y la lectura en un momento posterior si falla la técnica rápida inicial. Por tanto, el experimento no puede ser continuado para una evaluación estándar en un momento posterior.

Otros métodos han implicado monitorizar el consume de oxígeno microbiano por medidas del pH y/o cambio de color de la hemoglobina, o por el uso de colorantes, tales como cloruro de trifenil-5-tetrazolio y resazurina, que cambian el color en respuesta al potencial redox total del medio de ensayo líquido.

La monitorización del consumo de oxígeno disuelto por los microorganismos, como un marcador de su metabolismo, se ha estudiado desde hace muchos años. Por ejemplo, C. E. Clifton en 1937 monitorizó el consumo de oxígeno por microorganismos durante un período de siete días usando un matraz Warburg. Este método midió el cambio en la concentración de oxígeno de una manera lenta y engorrosa.

El electrodo de "Clark", un dispositivo electroquímico, también se usa comúnmente para medir el oxígeno disuelto. Desafortunadamente, el electrodo de Clark consume oxígeno durante su uso (reduciendo con ello el oxígeno disponible para los microorganismos) y el electrodo de tamaño "estándar" se usa típicamente sólo para medir volúmenes de 100 ml o mayores para impedir que el electrodo interfiera con las medidas.

Se ha descrito un electrodo de Clark en "miniatura", pero este electrodo es una pieza multi-componente complicada, que al igual que los electrodos más grandes, debe estar en contacto con la solución que se mide. Aunque puede usarse una membrana permeable al oxígeno para impedir que los componentes del electrodo del dispositivo interactúen con los constituyentes de la solución de ensayo, el oxígeno debe todavía equilibrarse entre la solución de ensayo y el sistema de medida y se consume una vez que pasa por la membrana.

Se han desarrollado sistemas ópticos que pueden proporcionar datos de la concentración de oxígeno para superar los inconvenientes de los sistemas de electrodos de Clark. La principal ventaja de dichos métodos ópticos es que la instrumentación requerida para determinar valores cuantitativos no entra en contacto físico con la solución de ensayo. Se conocen técnicas ópticas que permiten análisis tanto colorimétricos como fluorométricos para oxígeno que se llevan a cabo tanto rápida como reproduciblemente, y frecuentemente los costes de dichos análisis son bastante bajos. Por ejemplo se han descrito varias técnicas luminiscentes para la determinación de oxígeno que se basan en la capacidad del oxígeno para extinguir las emisiones fluorescentes o fosforescentes de una variedad de compuestos. Sin embargo, dichos métodos no se han adaptado fácilmente a la monitorización microbiana. Además, dichos sistemas, como el sistema del electrodo de Clark están limitados a monitorizar solamente el consumo de oxígeno disuelto por microorganismos.

La patente US-A-5.747.349 describe una formulación de sensor para detectar simultáneamente componentes gaseosos que comprende perlas de información múltiple revestidas con colorantes indicadores fluorescentes o un indicador de pH cromógeno.

La patente US-A-5.019.350 describe una formulación relacionada con dos o más colorantes fluorescentes embebidos en un polímero.

La patente US-A-4.795.814 describe también un sistema relacionado con dos colorantes fluorescentes embebidos en un polímero transparente para detectar simultáneamente O₂ y CO₂.

Se han descrito otros sistemas que proporcionan información sobre la presencia, identidad y susceptibilidad antimicrobiana de microorganismos en un periodo de ocho horas o menos. Wilkins y Stones en la patente US-A-4.200.493 describen un sistema que usa electrodos y un potenciómetro de alta impedancia para determinar la presencia de microorganismos. En la patente US-A-3.907.646 Wilkins et al., describen un método analítico que utiliza los cambios de presión en el espacio de cabeza de un matraz asociado con el crecimiento microbiano para la detección y vigilancia de los organismos. La patente US-A-4.220.715 de Ahnell, describe un sistema en donde el gas del espacio...

1. Una formulación de sensor para monitorizar simultáneamente al menos dos componentes de una composición de gases, que comprende:

en donde dicho colorante cromóforo y dichos al menos dos fluoróforos se mezclan dentro de dicha matriz de polímero antes de la polimerización de dicha matriz, comprendiendo además dicha formulación de sensor dos polvos de sílice diferentes, siendo dichos dos polvos de sílice un primer polvo de sílice y un segundo polvo de sílice: teniendo dicho primer polvo de sílice una mayor densidad en comparación con el segundo polvo de sílice de menor densidad, estando dicho fluoróforo revestido sobre gránulos de dicho primer polvo de sílice y estando dicho segundo fluoróforo revestido sobre dicho segundo polvo de sílice.

2. Una formulación de sensor de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho colorante cromóforo está dispersado uniformemente dentro de dicha matriz polímera.

3. Una formulación de sensor de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicho primer fluoróforo está segregado de dicho segundo fluoróforo dentro de dicha matriz polímera.

4. Una formulación de sensor de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicha matriz polímera comprende al menos dos ingredientes premezclados, un primer componente polímero y un segundo componente reticulante y opcionalmente, en donde dicha matriz polímera comprende además ingredientes premezclados de un catalizador y un inhibidor; y opcionalmente en donde dicho catalizador es un catalizador de platino.

5. Una formulación de sensor de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicha matriz polímera comprende además un inhibidor.

6. Un método para detectar la presencia de microorganismos que respiran, que comprende:

proporcionar una formulación de sensor, comprendiendo dicha formulación:

proporcionar un dispositivo de lectura de fluorescencia que tiene al menos un primer elemento sensor y un segundo elemento sensor; estando dicho primer elemento sensor sintonizado a la misma longitud de onda de dicho primer fluoróforo y estando dicho segundo elemento sensor sintonizado a la misma longitud de onda de dicho segundo fluoróforo;

proporcionar un microorganismo para monitorizar;

exponer dicho microorganismo a dicha formulación de sensor en presencia de dicho dispositivo de lectura de fluorescencia; y

registrar la respuesta de dicho primer elemento sensor y dicho segundo elemento sensor a dicho microorganismo.

7. Un método para monitorizar los efectos de una composición sobre el metabolismo de un microorganismo, que comprende:

proporcionar una formulación de sensor, comprendiendo dicha formulación:

proporcionar un dispositivo de lectura de fluorescencia que tiene al menos un primer elemento sensor y un segundo elemento sensor; estando dicho primer elemento sensor sintonizado a la misma longitud de onda de dicho primer fluoróforo y estando dicho segundo elemento sensor sintonizado a la misma longitud de onda de dicho segundo fluoróforo;

proporcionar un microorganismo para monitorizar;

exponer dicho microorganismo a dicha formulación de sensor en presencia de dicho dispositivo de lectura de fluorescencia; y

registrar la respuesta de dicho primer elemento sensor y dicho segundo elemento sensor a dicho microorganismo.

8. Uso de una formulación, que comprende:

en donde dicho colorante cromóforo y dichos al menos dos fluoróforos se mezclan dentro de dicha matriz de polímero antes de la polimerización de dicha matriz como un sensor para monitorizar simultáneamente al menos dos componentes de una composición de gases.