DIFERENCIACION DE CELULAS NO PRODUCTORAS DE INSULINA EN CELULAS PRODUCTORAS DE INSULINA GLP-1 O EXENDINA-4 Y UTILIZACIONES DE LAS MISMAS.

Procedimiento de diferenciación de células no productoras de insulina,

que expresan IDX-1, que portan receptores de GLP-1, en células productoras de insulina, que comprende poner en contacto las células no productoras de insulina, que expresan IDX-1, que portan receptores de GLP-1, in vitro con un factor de crecimiento seleccionado d e entre el grupo que consiste en exendina-4, polipéptidos que incluyen uno o más aminoácidos adicionales o sustituciones en posiciones distintas de las posiciones 1, 4, 6, 7 y 9 en la secuencia de aminoácidos de exendina-4 sin pérdida apreciable de actividad funcional en comparación con la exendina-4 en cuanto a la capacidad para diferenciar las células productoras de insulina de las células no productoras de insulina, que expresan IDX-1, que portan receptores de GLP-1, o fragmentos de exendina-4 que presentan la secuencia de aminoácidos de una de entre las SEC ID nos: 9 a 18, en el que las células no productoras de insulina, que expresan IDX-1, que portan receptores de GLP-1, son células no beta pancreáticas seleccionadas de entre el grupo que consiste en células productoras de amilasa pancreáticas, células acinares pancreáticas, líneas celulares de adenocarcinoma ductal pancreático, células Capan-I y células precursoras de epitelio ductal pancreático

Diferenciación de células no productoras de insulina en células productoras de insulina mediante GLP-1 o exendina-4 y utilizaciones de las mismas.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de diferenciación de células no productoras de insulina, que expresan IDX-1, que portan receptores de GLP-1, en células productoras de insulina, y a un procedimiento de estimulación de células productoras de amilasa pancreáticas para que produzcan tanto insulina como amilasa mediante exendina-4 y polipéptidos relacionados y fragmentos de los mismos. La presente invención se refiere además a la utilización de exendina-4 y polipéptidos relacionados y fragmentos de los mismos para la preparación de un medicamento para tratar la diabetes en un sujeto.

El páncreas de los mamíferos está compuesto por dos tipos distintos de tejido glandular, las células exocrinas que secretan enzimas digestivas al intestino y las células endocrinas que secretan hormonas a la corriente sanguínea. Tradicionalmente se creía que las células endocrinas se desarrollaban a partir de la cresta neural mientras que se creía que las células exocrinas se desarrollaban a partir del endodermo. Un trabajo más reciente sugiere que estos dos tipos de células pueden provenir de células precursoras endodérmicas comunes situadas a los largo del revestimiento epitelial de los conductos (Teitelman, 1996). Debe observarse que las células endocrinas son de diferenciación terminal y no se dividen para formar nuevas células endocrinas. Se cree que las células precursoras endodérmicas pancreáticas son las únicas células que producen nuevas células endocrinas pancreáticas.

El páncreas consiste en conductos, que transportan las enzimas exocrinas (amilasa y lipasa) al intestino; células acinares, que producen las enzimas exocrinas; e islotes de Langerhans, que contienen las células endocrinas que producen y secretan insulina, amilina y glucagón. Estas hormonas ayudan a mantener niveles de glucosa en sangre normales dentro de un intervalo notablemente estrecho.

Entre las células de islotes están las células beta que producen y secretan insulina. La producción y secreción de insulina por las células beta se controla mediante los niveles de glucosa en sangre. La liberación de insulina aumenta a medida que aumentan los niveles de glucosa en sangre. La insulina estimula la captación de glucosa por los tejidos diana y, por tanto, previene la hiperglucemia trasladando la glucosa a los tejidos para su almacenamiento.

La disfunción de células beta y la concomitante disminución en la producción de insulina pueden dar como resultado diabetes mellitus. En la diabetes tipo 1, el sistema inmunitario destruye completamente las células beta, dando como resultado una ausencia de células productoras de insulina (Physician's Guide to Insulin Dependent [Type 1] Diabetes Mellitus: Diagnosis and Treatment, Asociación Americana de la Diabetes, 1988). En la diabetes tipo 2, las células beta se vuelven progresivamente menos eficaces a medida que los tejidos diana se vuelven resistentes a los efectos de la insulina sobre la captación de glucosa. La diabetes tipo 2 es una enfermedad progresiva y la función de las células beta continúa deteriorándose a pesar del tratamiento en curso con cualquier agente disponible actualmente (Grupo de estudio prospectivo en el Reino Unido, 1995). Por tanto, las células beta están ausentes en las personas con diabetes tipo 1 y están funcionalmente alteradas en las personas con diabetes tipo 2.

Actualmente, se trata la disfunción de células beta de varias maneras diferentes. En el tratamiento de la diabetes tipo 1 o los estadios tardíos de la diabetes tipo 2, se utiliza la terapia de reemplazo de insulina. La terapia con insulina, aunque salva la vida, no restablece la normoglucemia, incluso cuando se utilizan infusiones continuas o inyecciones múltiples en regímenes complejos. Por ejemplo, los niveles posprandiales de glucosa continúan siendo excesivamente altos en individuos en terapia de reemplazo de insulina. Por tanto, la terapia con insulina debe administrarse mediante múltiples inyecciones diarias o infusión continua y los efectos deben monitorizarse cuidadosamente para evitar hiperglucemia, hipoglucemia, acidosis metabólica y cetosis.

El reemplazo de las células beta puede conseguirse con trasplantes de páncreas. (Scharp et al., 1991; Warnock et al., 1991). Dichos trasplantes, sin embargo, requieren encontrar un donante compatible, procedimientos quirúrgicos para implantar el tejido obtenido y la aceptación del injerto. Tras el trasplante en una persona con diabetes tipo 1, se requiere terapia inmunosupresora continua porque se reconocen y atacan a los antígenos de superficie celular de las células beta mediante los mismos procesos que destruyeron las células beta originariamente. Los fármacos inmunosupresores, tales como ciclosporina A, sin embargo, presentan numerosos efectos secundarios, incluyendo el aumento en el potencial para la infección. Por tanto, el trasplante puede dar como resultado numerosas complicaciones.

Las personas con diabetes tipo 2 generalmente se tratan con fármacos que estimulan la producción y secreción de insulina desde las células beta. Una desventaja principal de estos fármacos, sin embargo, es que se estimula la producción y secreción de insulina independientemente del nivel de glucosa en sangre. Por tanto, la ingesta de alimentos debe equilibrarse con la estimulación de la producción y secreción de insulina para evitar hipoglucemia o hiperglucemia.

En los últimos años, varios agentes nuevos han pasado a estar disponibles para tratar la diabetes tipo 2. Éstos incluyen metformina, acarbosa y troglitazona (véase Bressler y Johnson, 1997). Sin embargo, la disminución en hemoglobina Al c obtenida con estos agentes más nuevos es menor que la adecuada (Ghazzi et al., 1997), sugiriendo que no mejorarán el control a largo plazo de la diabetes mellitus.

Más recientemente, el péptido similar al glucagón tipo 1 (GLP-1), una hormona secretada normalmente por las células neuroendocrinas del intestino en respuesta a los alimentos, se ha sugerido como un nuevo tratamiento para la diabetes tipo 2 (Gutniak et al., 1992; Nauck et al., J. Clin. Invest., 1993). Este aumenta la liberación de insulina por las células beta incluso en sujetos con diabetes tipo 2 de larga duración (Nauck et al., Diabetologia, 1993). El tratamiento con GLP-1 presenta una ventaja con respecto a la terapia con insulina porque el GLP-1 estimula la secreción de insulina endógena, que se detiene cuando los niveles de glucosa en sangre disminuyen (Nauck et al., Diabetologia, 1993; Elahi et al., 1994). Cuando los niveles de glucosa en sangre son altos, el GLP-1 estimula la euglucemia mediante el aumento de la liberación y síntesis de insulina, la inhibición de la liberación de glucagón y la disminución del vaciado gástrico (Nauck et al., Diabetologia, 1993; Elahi et al., 1994; Wills et al., 1996; Nathan et al., 1992; De Ore et al., 1997). El GLP-1 también induce un aumento en los niveles de ARN mensajero de hexocinasa (Wang et al., Endocrinology 1995; Wang et al., 1996). Se sabe que el GLP-1 presenta un potente efecto de secreción de insulina sobre las células beta (Thorens y Waeber, 1993; Orskov, 1992) y aumenta la biosíntesis de insulina y la expresión génica de proinsulina cuando se añade a líneas celulares secretoras de insulina durante 24 horas (Drucker et al., 1987; Fehmann y Habener, 1992). En estudios utilizando células RIN 1046-38, el tratamiento de veinticuatro horas con GLP- aumentó la receptividad a la glucosa incluso después de que se hubiera eliminado el GLP-1 durante una hora y después de varias lavados de las células (Montrose-Rafizadeh et al., 1994). Por tanto, el GLP-1 es un agente liberador de insulina y un agente insulinotrópico (es decir un agente que aumenta la síntesis de insulina) conocido por presentar un efecto prolongado sobre las células beta. El GLP-1 es un producto de la modificación postraduccional del proglucagón. Se conocen en la técnica las secuencias de GLP-1 y sus fragmentos activos GLP-1 (7-37) y GLP-1(7-36) amida (Fehmann et al., 1995).

Se ha demostrado que los receptores de GLP-1 están presentes en el intestino y en los islotes pancreáticos (Id.). Los receptores pertenecen a una familia de receptores asociados a proteína G que incluye receptores de glucagón,...

1. Procedimiento de diferenciación de células no productoras de insulina, que expresan IDX-1, que portan receptores de GLP-1, en células productoras de insulina, que comprende poner en contacto las células no productoras de insulina, que expresan IDX-1, que portan receptores de GLP-1, in vitro con un factor de crecimiento seleccionado d e entre el grupo que consiste en exendina-4, polipéptidos que incluyen uno o más aminoácidos adicionales o sustituciones en posiciones distintas de las posiciones 1, 4, 6, 7 y 9 en la secuencia de aminoácidos de exendina-4 sin pérdida apreciable de actividad funcional en comparación con la exendina-4 en cuanto a la capacidad para diferenciar las células productoras de insulina de las células no productoras de insulina, que expresan IDX-1, que portan receptores de GLP-1, o fragmentos de exendina-4 que presentan la secuencia de aminoácidos de una de entre las SEC ID n^os: 9 a 18, en el que las células no productoras de insulina, que expresan IDX-1, que portan receptores de GLP-1, son células no beta pancreáticas seleccionadas de entre el grupo que consiste en células productoras de amilasa pancreáticas, células acinares pancreáticas, líneas celulares de adenocarcinoma ductal pancreático, células Capan-I y células precursoras de epitelio ductal pancreático.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células no productoras de insulina, que expresan IDX-1, que portan receptores de GLP-1, se ponen en contacto con el factor de crecimiento durante por lo menos veinticuatro horas.

3. Procedimiento de estimulación de células productoras de amilasa pancreáticas para que produzcan tanto insulina como amilasa, que comprende poner en contacto las células productoras de amilasa pancreáticas in vitro con un factor de crecimiento seleccionado de entre el grupo que consiste en exendina-4, polipéptidos que incluyen uno o más aminoácidos adicionales o sustituciones en posiciones distintas de las posiciones 1, 4, 6, 7 y 9 en la secuencia de aminoácidos de exendina-4 sin pérdida apreciable de actividad funcional en comparación con la exendina-4 en cuanto a la capacidad para diferenciar las células productoras de insulina de las células no productoras de insulina, que expresan IDX-1, que portan receptores de GLP-1, o fragmentos de exendina-4 que presentan la secuencia de aminoácidos de una de entre las SEC ID n^os: 9 a 18, en el que las células no productoras de insulina, que expresan IDX-1, que portan receptores de GLP-1, son células no beta pancreáticas seleccionadas del grupo que consiste en células productoras de amilasa pancreáticas, células acinares pancreáticas, líneas celulares de adenocarcinoma ductal pancreático, células Capan-I y células precursoras de epitelio ductal pancreático.

4. Utilización de un factor de crecimiento seleccionado de entre el grupo que consiste en exendina-4, polipéptidos que incluyen uno o más aminoácidos adicionales o sustituciones en posiciones distintas a las posiciones 1, 4, 6, 7 y 9 en la secuencia de aminoácidos de exendina-4 sin pérdida apreciable de actividad funcional en comparación con la exendina-4 en cuanto a la capacidad para diferenciar las células productoras de insulina de las células no productoras de insulina, que expresan IDX-1, que portan receptores de GLP-1, o de fragmentos de exendina-4 que presentan la secuencia de aminoácidos de una de entre las SEC ID n^os: 9 a 18, para la preparación de un medicamento para tratar la diabetes en un sujeto al que se le ha diagnosticado diabetes tipo 1, que comprende administrar al sujeto dicho factor de crecimiento mediante inyección en bolo diaria durante dos días para inducir la producción de insulina en las células no productoras de insulina, que expresan IDX-1, que portan receptores de GLP-1, en la que las células no productoras de insulina, que expresan IDX-1, que portan receptores de GLP-1, son células no beta pancreáticas seleccionadas de entre el grupo que consiste en células productoras de amilasa pancreáticas, células acinares pancreáticas, líneas celulares de adenocarcinoma ductal pancreático, células Capan-I y células precursoras de epitelio ductal pancreático.

5. Utilización de un factor de crecimiento seleccionado de entre el grupo que consiste en exendina-4, polipéptidos que incluyen uno o más aminoácidos adicionales o sustituciones en posiciones distintas de las posiciones 1, 4, 6, 7 y 9 en la secuencia de aminoácidos de exendina-4 sin pérdida apreciable de actividad funcional en comparación con la exendina-4 en cuanto a la capacidad para diferenciar las células productoras de insulina de las células no productoras de insulina, que expresan IDX-1, que portan receptores de GLP-1, o fragmentos de exendina-4 que presentan la secuencia de aminoácidos de una de SEC ID n^os: 9 a 18, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la diabetes en un sujeto, en la que: