VARIANTES DE LA PROTEÍNA DE FUSIÓN SENSIBLE AL CALCIO tdTOMATO-AEQUORINA.

Variantes de la proteína de fusión sensible al calcio tdTomato-aequorina.

La presente invención se refiere a proteínas derivadas de la proteína de fusión tdTomato-aequorina

, a una composición que las comprende, a la secuencia nucleotídica que las codifica, a su uso para la detección y/o cuantificación in vitro de la concentración de calcio intracelular, así como a un kit que las comprende y al uso del kit para el mismo fin. También se refiere al procedimiento de obtención de la proteína de fusión de la invención. Además, también se refiere a un método de cribado utilizando las proteínas de fusión de la invención.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201231220.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE CASTILLA-LA MANCHA.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: BAKAYAN,Adil, LLOPIS BORRÁS,Juan Francisco.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/68 (en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/435 (de animales; de humanos)

PDF original: ES-2445018_A1.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Variantes de la proteína de fusión sensible al calcio tdTomato-aequorina La presente invención se refiere a proteínas derivadas de la proteína de fusión tdTomato-aequorina, que emite en la región roja del espectro cuando la aequorina une el ión calcio. Las proteínas de la invención son útiles para la cuantificación de calcio intracelular. Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la Biomedicina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El calcio (Ca2+) es conocido por participar como segundo mensajero en el control de una gran variedad de procesos celulares en diferentes organismos. La aequorina (Aeq) es una fotoproteína sensible al Ca2+, un complejo formado por la proteína apoaequorina, el luminóforo coelenterazina (CLZ) y oxígeno molecular. Las técnicas de bioimagen para Ca2+ basadas en Aeq están bien establecidas. Esta fotoproteína emite luz azul cuando está en contacto con Ca2+ libre, y presenta una alta relación señal-ruido. Sin embargo, su bajo rendimiento cuántico limita la resolución espacio-temporal en medidas de una sola célula y su uso en bioimagen in vivo. Entre todos los sensores de Ca2+ disponibles, Aeq es un reportero de elección en numerosas aplicaciones debido a su extraordinaria flexibilidad. Por ejemplo, las propiedades funcionales de Aeq han sido alteradas mediante la incorporación de diferentes análogos de CLZ. Además, estudios de mutagénesis han aportado variantes con diferente sensibilidad al Ca2+, desplazamiento de la emisión, mejoría de la termoestabilidad de la proteína u otras características. Por otra parte, estos dos enfoques, mutaciones en apoaequorina más la elección de una CLZ sintética, se han combinado con éxito.

La transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) consiste en el paso de la energía del estado excitado de una fotoproteína luminiscente (dador de energía, como Aeq) , a un aceptor (como una proteína fluorescente, FP) ; de esta forma en lugar de la emisión de Aeq, se obtiene emisión del aceptor. Se ha utilizado BRET como una estrategia para el desplazamiento de la emisión azul de Aeq y la generación de tonos alternativos, por ejemplo verde, amarillo y rojo (Bakayan A., et al. PLoS One 2011; 6: e19520) . La primera proteína fluorescente roja (RFP) que se fusionó con Aeq como aceptor de BRET fue mRFP1, con un pico de emisión de 612 nm. Sin embargo, la transferencia de energía en estas fusiones fue muy limitada (Manjarres I. M., et al. Pflugers Arch 2008:

455: 961-970) . Más recientemente hemos llevado a cabo un estudio comparativo de Aeq fusionada con diferentes FPs, y se encontró que tdTomato, que presenta un máximo de emisión a 582 nm, fue un aceptor de energía adecuado. La quimera tdTomato-Aeq (tdTA) presentó el mayor porcentaje de cuentas por encima de 600 nm de todas las fusiones existentes, aunque la transferencia de energía no excedió el 50% (Bakayan A., et al. PLoS One 2011; 6: e19520) , y tiene dos picos de emisión (a 470 nm y a 582nm) , por lo que no es una proteína de fusión adecuada para estudios de Ca2+ en dos colores simultáneos (dos o más compartimentos, dos tipos celulares, etc) .

Existen fusiones de GFP con Aeq (GA) con una emisión verde (pico de 509 nm) pero es importante encontrar un sensor de Ca2+ que emita en la región roja, y que, a diferencia de tdTA, no presente dos picos de emisión. La ventaja de obtener variantes de Aeq con emisión roja es que, por un lado, se facilita la adquisición de imágenes de doble canal en combinación con GA que es una variante verde (Manjarres I. M., et al. Pflugers Arch 2008: 455: 961-970) , si se consigue el suficiente brillo y separación espectral entre la variante verde (GA) y la roja. Por otro lado, para el seguimiento de Ca2+ en los tejidos profundos de mamíferos vivos, se necesita que emita en la llamada ventana óptica (de 600 a 900 nm) , ya que la luz ultravioleta, azul y verde es considerablemente atenuada por los tejidos animales.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

El presente trabajo está dirigido a la obtención de un sensor bioluminiscente de Ca2+ de color rojo, tomando tdTA como punto de partida, mejorando la eficacia de la transferencia de energía, ajustando la afinidad del Ca2+ al nivel apropiado para la expresión de las quimeras en diferentes compartimentos celulares. Para este fin, se combinaron varios enfoques. Se mejoró la BRET al disminuir la distancia entre tdTomato y Aeq (comparado con tdTA) . La variante resultante se denominó AD1. Posteriormente, se aplicó mutagénesis dirigida en la proteína apoaequorina, lo que ha resultado en un porcentaje de BRET máximo, el aumento de la estabilidad de las proteínas quiméricas, y cambios en la sensibilidad al Ca2+. Finalmente, estas variantes se emparejaron con análogos de CLZ sintéticos y se ensayó su capacidad de informar de niveles de Ca2+ en dos compartimentos celulares de la misma célula (mediante protocolos de imagen en dos canales) , la movilización de Ca2+ por la estimulación repetitiva con un agonista que actúa sobre un receptor de membrana, y el registro de la actividad espontánea del Ca2+ celular.

Los autores de la presente invención han variado la configuración del enlace entre apoaequorina y tdTomato para maximizar la transferencia de energía. Una combinación de deleciones cortas en el extremo C terminal de tdTomato, N terminal de apoaequorina y la eliminación completa del péptido conector en tdTA ha producido variantes como AD1 con BRET muy eficiente, donde se recogió más del 77% de la luz por encima de 575 nm, aunque esta manipulación provocó una disminución en el brillo de un 28%. Se obtuvieron otras mejoras mediante la combinación de AD1 con mutaciones puntuales en la secuencia de apoaequorina descritas en la literatura, como Y82F, que provoca un desplazamiento hacia el rojo, y Q168R, que aumenta su termoestabilidad. Con ellas se obtuvo un resultado de hasta el 85% del total de la luz en la banda roja (variantes ADIF y ADIFQ) .

La bioluminiscencia celular se incrementó 7 veces por la mutación de termoestabilidad Q168R (variante ADNQ) , lo

que permitió la detección de cambios transitorios de Ca2+ con protocolos de adquisición rápida. Se logró la medición simultánea de Ca2+ citoplásmico y mitocondrial, mediante el emparejamiento apropiado de variantes de emisión verde y roja, junto con el ajuste de la sensibilidad al Ca2+ y la localización subcelular de las quimeras. Se obtuvieron imágenes de oscilaciones de Ca2+ espontáneas e inducidas por carbacol en células HEK individuales, con una combinación del biosensor rojo de una alta afinidad por Ca2+ y una CLZ sintética (CLZ-hcp) . En conclusión, las variantes de tdTA descritas en la presente invención mejoran BRET de Aeq a un emisor rojo hasta un valor máximo, lo que facilita poder tomar imágenes de Ca2+ en tejidos profundos de animales.

La tdTomato en la se refiere a un dímero de DsRed que se obtiene a partir del organismo Discosoma sp. (Shaner N. C., et al. NatBiotechnol 2004; 22: 1567-1572) y cuya secuencia de ácido nucléico se refieren a la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos se refiere a la SEQ ID NO: 2. La SEQ ID NO: 1 es idéntica a la secuencia nucleotídica en GenBank AY678269.1. La SEQ ID NO: 2 es idéntica a la secuencia de proteína AAV52169.1 en GenBank.

La apoaequorina utilizada en la presente invención se refiere a una proteína que, combinada con el cofactor CLZ, emite luz en la zona azul del espectro visible, que se aísla del organismo Aequorea victoria y cuya secuencia de ácido nucléico se refiere a la SEQ ID NO: 3 y cuya secuencia de proteínas se refiere la SEQ ID NO: 4. También se puede referir a cualquiera de las variantes de apoaequorina descritas que guardan al menos un 70% de identidad, por ejemplo Q7YTW8 (cuya secuencia nucleotídica en GenBank... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Proteína de fusión fluorescente roja que comprende

a. una subunidad (a) que consiste en una proteína con al menos un 70% de identidad con la proteína SEQ ID NO: 2, y

b. una subunidad (b) que consiste en una proteína fotoluminiscente sensible al calcio, con al menos un 70% de identidad con la proteína SEQ ID NO: 4,

donde la subunidad (b) está unida al extremo carboxilo-terminal de la subunidad (a) sin espaciador o mediante un polipéptido espaciador de hasta 19 aminoácidos.

2. Proteína según la reivindicación anterior donde el polipéptido espaciador consiste en un polipéptido de hasta 11 aminoácidos.

3. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde la subunidad (a) es la SEQ ID NO: 2 y/o la subunidad (b) es la SEQ ID NO: 4.

4. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la subunidad (a) consiste en al menos los aminoácidos consecutivos 1 al 465 ambos inclusive de la proteína SEQ ID NO: 2.

5. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde la subunidad (b) consiste en al menos los aminoácidos consecutivos 5 al 189 ambos inclusive de la proteína SEQ ID NO: 4.

6. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde el polipéptido espaciador es de entre 2 y 11 aminoácidos.

7. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde el polipéptido espaciador es la SEQ ID NO: 41.

8. Proteína según la reivindicación 6 donde el polipéptido espaciador es la SEQ ID NO: 42.

9. Proteína según la reivindicación 8 donde dicha proteína de fusión es SEQ ID NO: 26.

10. Proteína según la reivindicación 6 donde el polipéptido espaciador es serina-glicina.

11. Proteína según la reivindicación 10 donde dicha proteína de fusión es SEQ ID NO: 20.

12. Proteína según la reivindicación 10 donde dicha proteína de fusión es SEQ ID NO: 24.

13. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4 o 5, donde la subunidad (b) está unida al extremo carboxilo-terminal de la subunidad (a) sin espaciador.

14. Proteína según la reivindicación anterior, donde dicha proteína de fusión es SEQ ID NO: 22.

15. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 que comprende en la subunidad (b) una sustitución del aminoácido tirosina de la posición 82 por un aminoácido fenilalanina.

16. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 que comprende en la subunidad (b) una sustitución del aminoácido glutamina de la posición 168 por un aminoácido arginina.

17. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 que comprende en la subunidad (b) una sustitución del aminoácido asparragina de la posición 26 por un aminoácido aspártico.

18. Composición que comprende la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 en combinación con el cofactor CLZ de fórmula general (I) :

19. Composición según la reivindicación anterior, donde R1 es un fenilo o naftilo.

20. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 19, donde R1 es un arilo sustituido por un grupo OH

o halógeno, preferiblemente el halógeno es F, más preferiblemente el grupo está en posición para.

21. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, donde R2 es un fenilo o un pentilo.

22. Secuencia nucleotídica que comprende la secuencia que codifica una proteína fluorescente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

23. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 22 donde dicha secuencia es SEQ ID NO: 25.

24. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 22 donde dicha secuencia es SEQ ID NO: 19.

25. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 22 donde dicha secuencia es SEQ ID NO: 23.

26. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 22, donde dicha secuencia es SEQ ID NO:21

27. Célula que comprende la secuencia nucleotídica según las reivindicaciones 22 a 26.

28. Procedimiento para la obtención de la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 que comprende cultivar una célula según la reivindicación 27 en condiciones que permiten la expresión de dichas proteínas, donde dicha expresión se produce en bacterias, levaduras, baculovirus, células de mamífero en cultivo o cualquier otro sistema de expresión de proteína recombinante.

29. Procedimiento según la reivindicación 28, que además comprende aislar y/o purificar dichas proteínas.

30. Uso de la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, para la detección y cuantificación in vitro de la concentración de calcio en una célula o en un tejido.

31. Uso según la reivindicación 30 donde el calcio que se detecta se localiza en el interior de una célula.

32. Uso según la reivindicación 31 donde el calcio se localiza en la mitocondria de la célula.

33. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, donde la proteínas de fusión o la composición que la comprende, se encuentran en combinación con al menos una fotoproteína sensible a calcio, con emisión amarilla, verde o azul.

34. Método de cribado de ligandos de receptores de membrana que comprende:

a. cultivar una célula o tejido que exprese un receptor de membrana acoplado a la liberación de Ca2+ intracelular

b. poner en contacto una célula o tejido con la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1

a 17, o con la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26; 25

c. añadir a las células el cofactor CLZ,

d. Estimular las células con una sustancia;

e. Estimular las células o el tejido con un agonista conocido del receptor.

f. determinar la emisión de la fotoproteína sensible al Ca2+ por las células o tejido;

g. Cuantificar la luminiscencia emitida en respuesta a la sustancia, proporcional a la señal de Ca2+ intracelular.

35. Uso del método según la reivindicación 34 para la identificación de un antagonista de un receptor acoplado a la liberación de Ca2+ intracelular.

36. Uso del método según la reivindicación 34 para la determinación in vitro de la afinidad de una sustancia para un receptor de membrana acoplado a la liberación de Ca2+ intracelular;

37. Método de cribado de moduladores de enzimas que comprende:

a. cultivar una célula o tejido que exprese una enzima acoplada a la liberación de Ca2+ intracelular

b. poner en contacto una célula o tejido con la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, o con la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26.

c. añadir a las células el cofactor CLZ,

d. Estimular las células con una sustancia;

e. Estimular las células o el tejido con un activador conocido de la enzima.

f. determinar la emisión de la fotoproteína sensible al Ca2+ por las células o tejido;

g. Cuantificar la luminiscencia emitida en respuesta a la sustancia, proporcional a la señal de Ca2+ intracelular.

38. Uso del método según la reivindicación 37 para la determinación in vitro de la afinidad de una sustancia para una enzima acoplado a la liberación de Ca2+ intracelular;

39. Kit que comprende al menos una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, una composición según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, o al menos una secuencia nucleotídica recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26.

40. Uso del kit según la reivindicación 39, para la detección y/o cuantificación in vitro de niveles de calcio en una célula o en un tejido.

FIG. 1

FIG. 2

FIG. 3

FIG. 4

FIG. 5

FIG. 6

FIG. 7

FIG. 8

FIG. 9