Método de secuenciación de ADN mediante polimerización.

Método para la determinación de una secuencia de ácido nucleico, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) desnaturalizar una molécula de ácido nucleico bicatenario correspondiente a dicha secuencia de ácido nucleico, en el que al menos una de las bases de una de las hebras del ácido nucleico bicatenario está unida directa o indirectamente a un soporte, y en el que al menos una de las bases de la otra hebra del ácido nucleico bicatenario está unida a un soporte móvil;

b) hibridar una molécula de ácido nucleico monocatenario, "el cebador", con dicha molécula de ácido nucleico bicatenario desnaturalizada;

c) aplicar una tensión al cebador hibridado/molécula de ácido nucleico bicatenario obtenido en b);

d) incubar el cebador hibridado/molécula de ácido nucleico bicatenario obtenido en la etapa b) con una polimerasa en condiciones que conducirán a por lo menos una pausa en la replicación; y

e) determinar la posición de dicha pausa en la replicación con respecto a un extremo del ácido nucleico bicatenario, comprendiendo dicha determinación las etapas de:

• medir la distancia

(z) entre los dos extremos de la molécula de ácido nucleico bicatenario que están unidos al soporte;

• medir la distancia (zhigh) entre los dos extremos de la molécula de ácido nucleico bicatenario que están unidos al soporte, cuando dicha molécula de ácido nucleico bicatenario está desnaturalizada; y

• comparar z y zhigh, y

• determinar la posición de la pausa,

en el que dicha molécula de ácido nucleico bicatenario es una horquilla.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2011/058664.

Solicitante: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS).

Inventor/es: BENSIMON, DAVID, CROQUETTE,VINCENT, ALLEMAND,JEAN-FRANÇOIS, MANOSAS,MARIA, DING,FANG-YUAN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)

PDF original: ES-2539254_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Método de secuenciación de ADN mediante polimerización.

La presente invención se refiere a un método rápido para la determinación de una secuencia de ácido nucleico, ADN o ARN, que es útil, en particular, para la secuenciación de un ácido nucleico desconocido, o alternativamente, para la detección de una secuencia de ácido nucleico específica para diagnóstico.

Actualmente, la determinación de secuencia de ácido nucleico está en el corazón de la biología molecular. Por ejemplo, un amplio abanico de fenómenos biológicos se pueden evaluar mediante secuenciación de ADN de alto rendimiento, por ejemplo variación genética, expresión de ARN, interacciones proteína-ADN, y conformación cromosómica (véanse, para unos pocos ejemplos, Mitreva & Mardis, Methods Mol Biol., 533: 153-87, 29; Mardis, Genome Med, 1(4): 4, 29; Cloonan et al., Nat Methods, 5(7): 613-619, 28; Valouev et al., Genome Res., 18(7): 151-63, 28, Valouev et al, Nat Methods, 5(9):829-34, 28; Orscheln et al. Clin Infect Dis, 49(4): 536-42, 29; Walter et al, Proc Nati Acad Sci USA, 16(31): 1295-5, 29; Mardis et al, N Engl J Med, 361(11): 158-66, 29, Hutchinson, Nucí. Acids Res, 35(18): 6227-6237, 27).

Además, la demostración de la presencia de una secuencia de ADN específica en una muestra fisiológica constituye, actualmente, la línea principal de desarrollo de métodos de diagnóstico, por ejemplo para identificar la probabilidad de que las bacterias desarrollen resistencia antibiótica, anormalidades genéticas, los riesgos de cáncer asociado con modificaciones genéticas e infecciones víricas, por ejemplo infecciones asociadas con VIH o con virus de la hepatitis (véanse, por ejemplo, Zhang et al, Nature, 358: 591-593, 1992; Turner et al, J Bacteriol, 176(12): 378-3722, 1994; Weston et al, Infection and Impunity, 77(7): 284-2848, 29).

La secuenciación de ácido nucleico se lleva a cabo actualmente principalmente con implementaciones semiautomatizadas, a base de capilares, de la bioquímica de Sanger. El método clásico comprende una etapa de amplificación del ADN de interés, seguido de una etapa de "secuenciación en ciclo", en la que cada ronda de extensión del cebador se termina estocásticamente mediante la incorporación de didesoxinucleótidos (ddNTPs) marcados fluorescentemente. La secuencia se determina mediante separación electroforética de alta resolución de los productos de extensión monocatenarios, marcados en los extremos, en un gel polimérico a base de capilar. La electroforesis simultánea en 96 o 384 capilares independientes proporciona un nivel limitado de paralelización.

La elevada demanda de secuenciación de bajo coste ha conducido al desarrollo de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento que paralelizan el proceso de secuenciación, produciendo miles o millones de secuencias a la vez (Shendure y Ji, Nat Biotechnol, 26(1): 1135-45. 28). Las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento están destinadas a reducir el coste de la secuenciación del ADN más allá de lo que es posible con métodos estándar de terminador marcado con colorante. Actualmente, este rendimiento tan elevado se logra con sacrificios sustanciales en longitud y exactitud de las lecturas individuales cuando se compara con la secuenciación de Sanger. Los ejemplos de tales métodos nuevos incluyen las tecnologías de 454 y Solexa. Estas tecnologías permiten la secuenciación aleatoria de genomas completos sin clonar en E. coli o cualquier célula hospedante. Las bibliotecas de fragmentos de ADN cortos, flanqueados por adaptadores, capturados en la superficie de perlas se amplifican mediante PCR de emulsión. La secuenciación se lleva a cabo usando síntesis cebada mediante ADN polimerasa. En el método de 454 (también conocido como "pirosecuenciación"), la matriz se presenta con cada uno de los cuatro dNTPs, secuencialmente, y la cantidad de incorporación se monitoriza mediante detección luminométrica del pirofosfato liberado. Una diferencia clave entre este método y el Solexa es que este último usa nucleótidos que terminan la cadena. El marcador fluorescente en la base terminadora se puede eliminar para dejar un término 3 no bloqueado, haciendo la terminación de la cadena un proceso reversible. La tecnología SOLiD se basa en la ligación de sondas dibásicas marcadas fluorescentemente a un cebador secuenciador hibridado a una secuencia adaptadora en el molde de la biblioteca amplificado de forma clonal. La especificidad de la sonda dibásica se logra interrogando cada 1a y 2a base en cada reacción de ligación. Se realizan múltiples ciclos de ligación, detección y escisión, determinando el número de ciclos la longitud de lectura eventual. En contraste con las tres tecnologías previas, que requieren todas ellas una primera etapa de amplificación, la plataforma Helicos permite la secuenciación de moléculas de ADN individuales. Esta tecnología se basa en el uso de un sistema de detección muy sensible de la incorporación de nucleótidos fluorescentes para interrogar directamente moléculas de ADN individuales vía secuenciación mediante síntesis.

Tales métodos se describen, por ejemplo, en la patente US n° 4.882.127. patente US n° 4.849.77; patente US n° 7.556.922; patente US n° 6.723.513; solicitud de patente PCT n° WO 3/66896; solicitud de patente US n° US 28/2392; solicitud de patente PCT n° WO 26/84132; solicitud de patente US n° US 29/186349; solicitud de patente US n° US 29/18186; solicitud de patente US n° US 29/181385; solicitud de patente US n° US 26/275782; patente europea EP-B1-1141399; Shendure y Ji, Nat Biotechnol, 26(1): 1135-45. 28; Pihlak et al, Nat Biotechnol, 26(6): 676-684, 28; Fuller et al, Nature Biotechnol, 27(11): 113-123, 29; Mardis, Genome Med, 1(4): 4, 29; Metzker, Nature Rev. Genet, 11(1): 31-46, 21. En particular, la solicitud de patente PCT n° WO 27/111924 describe un método para la determinación de una secuencia de ácido nucleico, en el que el movimiento de una polimerasa procesiva selectiva de nucleótido se registra a lo largo de un molde polinucleotídico.

Sin embargo, todos los métodos desarrollados hasta el momento presentan serios inconvenientes. En particular, todos ellos usan nucleótidos marcados (por ejemplo, fluorescentes), contribuyendo así a incrementar seriamente los costes globales. Además, todos estos nuevos métodos salvo uno (la plataforma Helicos) requieren amplificación de la secuencia diana antes de la secuenciación, lo que por un lado consume tiempo, por otro lado incrementa la probabilidad de errores, y tiene mucha tendencia a la contaminación. Además, los métodos que implican técnicas mecánicas en lugar de bioquímicas carecen de sensibilidad (Maier et al., Proc. Nati., Acad. Sci. U.S.A., 97(22): 122-127, 2; Wuite et al., Nature, 44(6773): 13-16, 2; documento US 21/35252). De este modo, todavía existe la necesidad de un nuevo método muy sensible que permita la secuenciación de moléculas individuales.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un método para la determinación de una secuencia de ácido nucleico mediante manipulación física. En particular, dicho método comprende las etapas de determinar la localización física del sitio en el que se produce una pausa de la replicación, y deducir a partir de ello información sobre la secuencia del ácido nucleico.

El método según la presente invención, basado en técnicas físicas y tratamientos electrónicos, difiere de los enfoques actuales, que son químicos o bioquímicos. Sus ventajas son numerosas:

1) Permite la secuenciación de una molécula individual, y de este modo no requiere una etapa de amplificación

previa (por ejemplo mediante PCR).

2) Es bastante más barato que los métodos de la técnica, puesto que se usan moléculas... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para la determinación de una secuencia de ácido nucleico, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) desnaturalizar una molécula de ácido nucleico bicatenario correspondiente a dicha secuencia de ácido nucleico, en el que al menos una de las bases de una de las hebras del ácido nucleico bicatenario está unida directa o indirectamente a un soporte, y en el que al menos una de las bases de la otra hebra del ácido nucleico bicatenario está unida a un soporte móvil;

b) hibridar una molécula de ácido nucleico monocatenario, "el cebador", con dicha molécula de ácido nucleico bicatenario desnaturalizada;

c) aplicar una tensión al cebador hibridado/molécula de ácido nucleico bicatenario obtenido en b);

d) incubar el cebador hibridado/molécula de ácido nucleico bicatenario obtenido en la etapa b) con una polimerasa en condiciones que conducirán a por lo menos una pausa en la replicación; y

e) determinar la posición de dicha pausa en la replicación con respecto a un extremo del ácido nucleico bicatenario, comprendiendo dicha determinación las etapas de:

medir la distancia (z) entre los dos extremos de la molécula de ácido nucleico bicatenario que están unidos al soporte;

medir la distancia (Zh¡gh) entre los dos extremos de la molécula de ácido nucleico bicatenario que están unidos al soporte, cuando dicha molécula de ácido nucleico bicatenario está desnaturalizada; y

comparar z y zhigh, y

determinar la posición de la pausa,

en el que dicha molécula de ácido nucleico bicatenario es una horquilla.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico bicatenario está desnaturalizado en la etapa a) alejando los soportes.

3. Método según la reivindicación 2, en el que se aplica una fuerza física superior o igual a 15 pN, preferiblemente superior o igual a 17 pN, más preferentemente superior o igual a 18 pN, a la molécula bicatenaria alejando los soportes.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha tensión de la etapa c) está comprendida entre 12 pN y 1 pN.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las etapas a) a e) se repiten varias veces para acumular mediciones e incrementar la relación señal/ruido.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cebador se extiende mediante la actividad de dicha polimerasa, y el proceso de extensión se detiene antes de que dicha polimerasa alcance el bucle de la molécula de ácido nucleico bicatenario.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una etapa adicional de reducir la fuerza física aplicada a la molécula de ácido nucleico bicatenario a menos de o igual a 5 pN.

8. Método según la reivindicación 7, en el que se activa la actividad de exonucleasa de dicha polimerasa.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una etapa adicional de desensamblar la hebra sintetizada recientemente.

1. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se repiten las etapas a) a e).

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la polimerasa es una enzima selectiva de nucleótido, y las condiciones de la etapa d) incluyen utilizar una mezcla de reacción que altera la velocidad para el movimiento procesivo de la enzima para un nucleótido específico.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-1, en el que las condiciones de la etapa d) incluyen utilizar una mezcla de reacción que comprende didesoxinucleótidos además de desoxinucleótidos.