Regulación decreciente de la expresión génica utilizando microRNAs artificiales.

Un fragmento de ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de desoxirribonucleótidos expuesta en SEQID NO:

16 en donde (i) los nucleótidos 249 a 269 de SEQ ID NO: 16 están reemplazados por una primera subsecuenciavariable de nucleótidos de tamaño comprendido entre 19 y 24 nucleótidos dependiendo de una secuenciadiana cuya expresión debe reducirse, (ii) los nucleótidos 316 a 336 de SEQ ID NO: 16 están reemplazados por unasegunda subsecuencia variable de nucleótidos de tamaño comprendido entre 19 y 24 nucleóticos, siendo dichasegunda subsecuencia variable de nucleótidos capaz de hibridarse a la primera subsecuencia variable, y (iii) elmiRNA precursor producido por dicho fragmento aislado de ácido nucleico tiene la misma estructura troncal que elmiRNA precursor producido por SEQ ID NO: 16 endógena.

Regulación decreciente de la expresión génica utilizando microRNAs artificiales Campo De La Invención El campo de la presente invención se refiere, en general, a la biología molecular de las plantas. En particular, la invención se refiere a constructos y métodos para regular en sentido decreciente la expresión de secuencias direccionadas.

Antecedentes Los microRNAs (miRNAs) fueron identificados por primera vez hace sólo unos cuantos años, pero ya está claro que juegan un papel importante en la regulación de la actividad génica. Estos RNAs no codificantes de 20-22 nucleótidos tienen la capacidad de hibridarse por apareamiento de bases con mRNAs diana específicos y regular en sentido decreciente la expresión de estos transcritos, por medio de de la escisión del RNA o de la represión traduccional.

Estudios recientes han indicado que los miRNAs tienen funciones importantes durante el desarrollo. En las plantas, se ha demostrado que los mismos controlan una diversidad de procesos del desarrollo que incluyen el tiempo de floración, la morfología de las hojas, la polaridad de los órganos, la morfología floral, y el desarrollo de las raíces (revisado por Mallor y y Vaucheret (2006) Nat Genet 38: S31-36) . Dado el papel regulador establecido de los miR-NAs, es probable que los mismos estén implicados también en el control de algunos de los rasgos principales de las cosechas tales como la tolerancia a la sequía y la resistencia a las enfermedades.

Los miRNAs son transcritos por la RNA-polimerasa II como mensajes poliadenilados y protegidos terminalmente conocidos como pri-miRNAs. Estos pri-miRNAs se procesan en transcritos de menor tamaño conocidos como premiRNAs, y estos precursores tienen la capacidad de formar estructuras estables en horquilla (revisado por Bartel (2004) Cell 116: 281-297; Jones-Rhoades MW, Bartel DP, Bartel B. MicroRNAs and their regulator y roles in plants. Annu Rev Plant Biol. 2006; 57: 19-53) . Mientras que los pro-miRNAs son procesados a pre-miRNAs por Drosha en el núcleo y Dicer escinde los pre-miRNAs en el citoplasma de los metazoos, la maduración del miRNA en las plantas difiere del camino en los animales debido a que las plantas carecen de un homólogo de Drosha. En su lugar, la enzima RNasa III DICER-LIKE 1 (DCL1) , que es homóloga a la Dicer animal, puede poseer la función de Drosha además de su conocida función en el procesamiento de la horquilla (Kurihara y Watanabe (2004) Proc Natl Acad Sci 101: 12753-12758) .

Los microRNAs artificiales (amiRNAs) han sido descritos recientemente en secuencias de Arabidopsis direccionadas contra mRNA viral (Niu et al. (2006) Nature Biotechnology 24: 1420-1428) o genes endógenos (Schwab et al. (2006) Plant Cell 18: 1121-1133) . El constructo amiRNA puede expresarse en promotores diferentes a fin de cambiar el modelo espacial de silenciación (Schwab et al. (2006) Plant Cell 18: 1121-1133) . Los miRNAs artificiales reemplazan el microRNA y su secuencia estrella complementaria en un miRNA precursor y sustituyen secuencias que están direccionadas a un mRNA a silenciar. La silenciación por miRNAs endógenos puede encontrarse en una diversidad de patrones de expresión espaciales, temporales y del desarrollo (Parizotto et al. (2007) Genes Dev 18: 2237-2242; Álvarez et al. (2006) Plant Cell 18: 1134-51) . El miRNA artificial puede construirse para capturar y extender a la vez la diversidad y especificidad en los patrones de silenciación. Hasta la fecha no existe informe alguno de la utilización de amiRNAs en plantas de cosecha.

WO 2004/009779 publicado el 29 de enero de 2004 describe composiciones y métodos para modular la expresión génica en plantas.

La Publicación de Solicitud de Patente US 2005/0138689 del Cesionario de la Solicitante y publicada el 23 de junio de 2005 describe miRNAs y su uso en la silenciación de una secuencia diana.

Breve Descripción Del Listado Se Secuencias La invención puede comprenderse más plenamente a partir de la descripción detallada siguiente y el Listado de Secuencias que se acompaña, que forman parte de esta solicitud.

Las descripciones de secuencia resumen el Listado de Secuencias que se adjunta. El Listado de Secuencias contiene códigos de una sola letra para los caracteres de secuencia de los nucleótidos y códigos de una sola letra y de tres letras para los aminoácidos como se definen en los estándares de la IUPAC-IUB descritos en Nucleic Acids Research 13: 3021-3030 (1985) y en el Biochemical Journal 219 (2) : 345-373 (1984) .

SEQ ID NOs: 1-12 corresponden a iniciadores útiles para amplificación de precursores de microRNA (miRNA) genómicos de soja.

SEQ ID NOs: 13-18 corresponden a secuencias precursoras de miRNA de soja para 156c, 159, 166b, 168c, 396b y 398b, respectivamente.

SEQ ID NOs: 19-21 corresponde a la secuencia artificial de miRNA (amiRNA) utilizada para silenciar los transcritos de lipoxigenasa (lox) de soja, desaturasa de ácidos grasos 2-1 (fad 2-1) , o la desaturasa de ácidos grasos 2-2 (fad 22) , respectivamente.

SEQ ID NOs: 22-30 corresponden a "secuencias estrella" contenidas en precursores de amiRNA para 156c-lox, 159lox, 166b-lox, 168c-lox, 398b-lox, 159-fad2-1b, 166b-fad2-1b, 396b-fad2-1b, y 159-fad2-2, respectivamente. Las secuencias estrella son las secuencias en gran parte complementarias dentro del precursor de miRNA que forman un dúplex con el miRNA.

SEQ ID NOs: 31-39 corresponden a precursores de amiRNA para156c-lox, 159-lox, 166b-lox, 168c-lox, 398b-lox, 159-fad2-1b, 166b-fad2-1b, 396b-fad2-1b, and 159-fad2-2, respectivamente. Estos precursores, cuando se expresan en soja, dirigen la silenciación de los transcritos endógenos lox, fad 2-1, o fad 2-2.

SEQ ID NOs: 40-42 corresponden a la secuencia de amiRNA direccionada a fatB, una secuencia de tioesterasa de soja, y las secuencias estrella correspondientes para los precursores 159 y 396b, respectivamente.

SEQ ID NOs: 43-46 corresponden a cuatro versiones (a-d) de secuencias de amiRNA direccionadas a fosfoglucomutasa de soja, respectivamente. Precursores que contienen estas secuencias estrella son 159-PGMa, 168c-PGMb, 159-PGMc, y 159-PGMd, respectivamente. Precursores que contienen estas secuencias estrella son 159-PGMa, 168c-PGMb, 159-PGMc, y 159-PGMd, respectivamente.

Sumario De La Invención La presente descripción se refiere a un fragmento de ácido nucleico aislado que comprende un miRNA precursor, correspondiendo sustancialmente dicho miRNA precursor a la secuencia de desoxirribonucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 13 (i) en donde los nucleótidos 513 a 533 de SEQ ID NO: 13 están reemplazados por una primera subsecuencia variable de nucleótidos de tamaño comprendido entre aproximadamente 19 y aproximadamente 30 nucleótidos dependiendo de la secuencia diana cuya expresión debe reducirse y (ii) en donde adicionalmente los nucleótidos 384 a 407 de SEQ ID NO: 13 están reemplazados por una segunda subsecuencia variable de nucleótidos de tamaño comprendido entre aproximadamente 19 y aproximadamente 30 nucleótidos, siendo dicha segunda subsecuencia variable de nucleótidos capaz de hibridarse a la primera subsecuencia variable del miRNA precursor.

Otros fragmentos nucleicos aislados que son de interés también incluyen los siguientes:

a) un fragmento de ácido nucleico aislado que comprende un miRNA precursor, correspondiendo sustancialmente dicho miRNA precursor a la secuencia de desoxirribonucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 14 (i) en donde los nucleótidos 275 a 295 de SEQ ID NO: 14 están reemplazados por una primera subsecuencia variable de nucleótidos de tamaño comprendido entre aproximadamente 19 y aproximadamente 30 nucleótidos dependiendo de la secuencia diana cuya expresión debe reducirse y (ii) en donde adicionalmente los nucleótidos 121 a 141 de SEQ ID NO: 14 están reemplazados por una segunda subsecuencia variable de nucleótidos de tamaño comprendido entre aproximadamente 19 y aproximadamente 30 nucleótidos, siendo dicha segunda subsecuencia variable de nucleótidos capaz de hibridarse a la primera subsecuencia variable del miRNA precursor;

b) un fragmento de ácido nucleico aislado que comprende un miRNA precursor, correspondiendo sustancialmente dicho miRNA precursor a la secuencia de desoxirribonucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 15 (i) en donde los nucleótidos 262 a 282 de SEQ ID NO: 15 están reemplazados por una primera subsecuencia variable de nucleótidos de tamaño comprendido entre aproximadamente 19 y aproximadamente 30 nucleótidos dependiendo de la secuencia diana cuya expresión debe reducirse y (ii) en donde adicionalmente los nucleótidos 155 a 175 de SEQ ID NO: 15 están reemplazados por una segunda subsecuencia variable de nucleótidos de tamaño comprendido entre aproximadamente 19 y... [Seguir leyendo]

1. Un fragmento de ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de desoxirribonucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 16 en donde (i) los nucleótidos 249 a 269 de SEQ ID NO: 16 están reemplazados por una primera subsecuencia variable de nucleótidos de tamaño comprendido entre 19 y 24 nucleótidos dependiendo de una secuencia diana cuya expresión debe reducirse, (ii) los nucleótidos 316 a 336 de SEQ ID NO: 16 están reemplazados por una segunda subsecuencia variable de nucleótidos de tamaño comprendido entre 19 y 24 nucleóticos, siendo dicha segunda subsecuencia variable de nucleótidos capaz de hibridarse a la primera subsecuencia variable, y (iii) el miRNA precursor producido por dicho fragmento aislado de ácido nucleico tiene la misma estructura troncal que el miRNA precursor producido por SEQ ID NO: 16 endógena.

2. Un constructo recombinante que comprende el fragmento de ácido nucleico aislado de la reivindicación 1 enlazado operativamente a al menos una secuencia reguladora.

3. Una célula vegetal que comprende el constructo recombinante de la reivindicación 2.

4. La célula vegetal de la reivindicación 3 en donde la célula vegetal es una célula de planta monocotiledónea.

5. Un método para reducir la expresión de una secuencia diana en una célula vegetal, comprendiendo dicho méto15 do:

(a) transformar al menos una célula de planta con un constructo de ácido nucleico que comprende la secuencia de desoxirribonucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 16 en donde (i) los nucleótidos 249 a 269 de SEQ ID NO: 16 están reemplazados por una primera subsecuencia variable de nucleótidos de tamaño comprendido entre 19 y 24 nucleótidos dependiendo de una secuencia diana cuya expresión debe reducirse, (ii) los nucleótidos 316 a 336 de SEQ ID

NO: 16 están reemplazados por una segunda subsecuencia variable de nucleótidos de tamaño comprendido entre 19 y 24 nucleótidos, siendo dicha segunda subsecuencia variable de nucleótidos capaz de hibridarse a la primera subsecuencia variable, y (iii) el miRNA precursor producido por dicho fragmento aislado de ácido nucleico tiene la misma estructura troncal que el miRNA precursor producido por SEQ ID NO: 16 endógena; y

(b) seleccionar aquella o aquellas células vegetales transformadas cuyo nivel de expresión de la secuencia diana es reducido cuando se compara con el nivel de expresión de la secuencia diana en una célula de la planta de tipo salvaje.

6. El método de la reivindicación 5 en donde la célula vegetal es una célula de planta monocotiledónea.

7. Un mRNA artificial transcrito a partir del fragmento de ácido nucleico aislado de la reivindicación 1.