Producción de ácidos grasos y derivados de los mismos.

Microorganismo que comprende una o mas secuencias de acido nucleico ex6geno que codifican para un polipeptido que comprende una ester de cera sintasa de EC 2.3.1.75

, y una secuencia de acido nucleico que codifica para un polipeptido que comprende una acetil-CoA carboxilasa de EC 6.4.1.2, en el que dichas secuencias de acido nucleico se sobreexpresan.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2007/011923.

Solicitante: LS9, Inc.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 600 Gateway Boulevard South San Francisco, CA 94080 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: BERRY, DAVID, KEASLING,Jay D, HU,ZHIHAO, CHURCH,GEORGE, FRIEDMAN,LISA, SCHIRMER,ANDREAS, BRUBAKER,SHANE, DEL CARDAYRE,STEPHEN B, SOMERVILLE,CHRIS.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > C12N1/00 (Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo)

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Fragmento de la descripción:

Producción de ácidos grasos y derivados de los mismos Campo

Se proporcionan microorganismos modificados por ingeniería genética que producen productos de la ruta de 5 biosíntesis de ácidos grasos (derivados de ácidos grasos), así como métodos de su uso.

Antecedentes

Los desarrollos en la tecnología han ido acompañados por un aumento en la dependencia de fuentes de combustible y tales fuentes de combustibles están volviéndose cada vez más limitadas y difíciles de adquirir. Al tener lugar la combustión de combustibles fósiles a una tasa sin precedentes, es probable que la demanda mundial de 1 combustible pronto sea mayor que los suministros de combustible actuales.

Como resultado, se han dirigido esfuerzos hacia el aprovechamiento de fuentes de energía renovable, tales como luz solar, agua, viento y biomasa. El uso de biomasa para producir nuevas fuentes de combustible que no se derivan de fuentes de petróleo (es decir, biocombustible) ha surgido como una opción alternativa. El biocombustible (biodiésel) es un combustible inflamable biodegradable, de combustión limpia compuesto por ésteres y alcanos de 15 cadena larga. Puede usarse biodiésel en la mayoría de los motores diésel de combustión interna o bien en una forma pura, que se denomina biodiésel puro", o bien como una mezcla en cualquier concentración con diésel de petróleo normal. Los métodos actuales de producción de biodiésel implican la transesterificación de triacilglicéridos (principalmente aceite vegetal) que conduce a una mezcla de ésteres de ácidos grasos y el producto secundario no deseado glicerina, proporcionando por tanto un producto que es heterogéneo y un producto de desecho que provoca 2 ineficiencias económicas.

El documento DE 1 24 52115 A1 se refiere a microorganismos que son adecuados para la preparación de ésteres de ácidos grasos, y a procedimientos para la producción microbiana de ácidos grasos esterifícados con alcoholes de cadena corta usando estos microorganismos.

Kalscheuer et al. (Appl. Environ. Microbiol. 26, 72(2):1373-9) describen la biosíntesis de ésteres de cera en una 25 cepa de E. coli recombinante que expresa una acil-CoA reductasa bifuncional que produce alcohol graso y una éster de cera sintasa.

Lardizabal et al. (Plant Physiology 2, 122:645-5) describen la purificación de una cera sintasa de embrión de jojoba, la clonación de su ADNc, y la producción de altos niveles de cera en semillas de Arabidopsls transgénica.

James y Cronan (J. Biol. Chem. 24, 279(4):252-7) describen que el gen de AccA codifica para una subunidad de 3 la acetil-CoA carboxilasa, que cataliza la primera etapa comprometida en el metabolismo de ácidos grasos.

Wu et al. (Lipids 1981, 16(12):897-92) se refiere a estudios de biosíntesis de ceras mediante el desarrollo de semilla de jojoba: III. Biosíntesis de ésteres de cera a partir de acil-CoA y alcoholes de cadena larga.

Rock y Jackowski (J. Biol. Chem. 1985, 26(23):1272-4) se refieren a rutas para la incorporación de ácidos grasos exógenos en fosfatidiletanolamina en E. coli.

Holtzapple y Schmidt-Dannert 27 (J. Bacteriol. 27,189(1):384-12) describen la identificación y caracterización de una coenzima A isoprenoide sintetasa y éster de cera sintasas en Marinobacter hydrocarbonoclasticus DSM 8798.

Sumario

Se dan a conocer en el presente documento microorganismos recombinantes que pueden sintetizar productos 4 derivados de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos (derivados de ácidos grasos), y opcionalmente liberar tales productos al caldo de fermentación. Tales derivados de ácidos grasos son útiles, entre otros, como biocombustibles y productos químicos especializados. Estos biocombustibles y productos químicos especializados pueden usarse para producir productos adicionales, tales como complementos nutricionales, polímeros, sustitutos de parafina y productos para el cuidado personal.

Los microorganismos recombinantes dados a conocer en el presente documento pueden modificarse por ingeniería genética para producir diversos derivados de ácidos grasos incluyendo, pero sin limitarse a, alcoholes de cadena corta tales como etanol, propanol, isopropanol y butanol, alcoholes grasos, ésteres de ácidos grasos, hidrocarburos y ésteres de ceras.

En un ejemplo, se da a conocer en el presente documento un método para modificar un microorganismo de modo 5 que produzca, y opcionalmente libere, derivados de ácidos grasos generados a partir de una fuente de carbono renovable. Tales microorganismos se modifican por ingeniería genética, por ejemplo, introduciendo una secuencia de ADN exógeno que codifica para una o más proteínas que pueden metabolizar una fuente de carbono renovable

para producir, y en algunos ejemplos secretar, un derivado de ácido graso. Los microorganismos modificados pueden usarse entonces en un procedimiento de fermentación para producir derivados de ácidos grasos útiles usando la fuente de carbono renovable (biomasa) como material de partida. En algunos ejemplos, se usa un microorganismo existente que puede tratarse genéticamente debido a la facilidad de modificación por ingeniería genética de sus rutas para controlar el crecimiento, la producción y reducir o eliminar reacciones secundarias que reducen la eficacia de la ruta de biosíntesis. Además, tales microorganismos modificados pueden usarse para consumir fuentes de carbono renovables con el fin de generar combustibles que pueden usarse directamente como biocombustibles, sin la necesidad de métodos especiales para su almacenamiento o transporte. En otros ejemplos, se modifican por ingeniería genética microorganismos que producen de manera natural hidrocarburos para que sobreproduzcan hidrocarburos expresando secuencias de ácido nucleico exógeno que aumentan la producción de ácidos grasos.

Se dan a conocer en el presente documento microorganismos que producen derivados de ácidos grasos que tienen niveles de saturación, ramificación y longitud de la cadena de carbono definidos. En ejemplos particulares, la producción de productos homogéneos disminuye el coste global asociado con la fermentación y separación. En algunos ejemplos se dan a conocer microorganismos que incluyen una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican para al menos una tioesterasa (EC 3.1.2.14) y al menos una cera sintasa (EC 2.3.1.15). En otros ejemplos, se dan a conocer microorganismos que incluyen una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican para al menos una tioesterasa (EC 3.1.2.14) y al menos una alcohol acetiltransferasa (2.3.1.84). En aún otros ejemplos, se dan a conocer microorganismos que incluyen una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican para al menos una tioesterasa (EC 3.1.2.14), al menos una acil-CoA reductasa (EC 1.2.1.5) y al menos una alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1). También se dan a conocer microorganismos que expresan una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican para al menos una tioesterasa (EC 3.1.2.14) y al menos una acil-CoA reductasa que forma alcohol graso (1.1.1.*). Los péptidos de tioesterasa codificados por las secuencias de ácido nucleico exógeno pueden elegirse para proporcionar productos homogéneos.

En algunos ejemplos el microorganismo que se modifica por ingeniería genética para producir el derivado de ácido graso es E. coli, Z. mobilis, Rhodococcus opacus, Ralstonla eutropha, Vibrio fumissii, Saccharomyces cerevisiae, Lactococcus lactis, Streptomycetes, Stenotrophomonas maltophila, Pseudomonas o Micrococus leuteus y sus microorganismos relacionados.

En otros ejemplos pueden modificarse por ingeniería genética microorganismos que producen hidrocarburos de manera endógena para sobreproducir hidrocarburos optimizando la ruta de biosíntesis... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1.

Microorganismo que comprende una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican para un

polipéptido que comprende una áster de cera sintasa de EC 2.3.1.75, y una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una acetil-CoA carboxilasa de EC 6.4.1.2, en el que dichas secuencias de ácido nucleico se sobreexpresan.

2.

Microorganismo según la reivindicación 1, en el que el microorganismo es una E.coli.

3.

Microorganismo según la reivindicación 1, en el que el microorganismo comprende adicionalmente un derivado de ácido graso.

4.

Microorganismo según la reivindicación 3, en el que el microorganismo expresa una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican para una enzima seleccionada de uno o más componentes del complejo de la deshidrogenasa de cetoácidos de cadena ramificada de EC 1.2.4.4, Uve de EC 2.6.1.42, Ipd de EC 1.8.1.4, Ccr de EC 1.1.19, IcmA de EC 5.4.99.2, IcmB de 5.4.99.13, fabH de EC 2.3.1.18, fabF de EC 2.3.1.179, fabH3 de EC 2.3.1.18, fabC3 de registro NP_823468, beta-cetoacil-ACP sintasa II de EC 2.3.1.18, enoil-CoA reductasas de EC 1.3.1.34, enoil-CoA isomerasa de EC 4.2.1.-, y combinaciones de

las mismas, en el que el derivado de ácido graso está ramificado.

Microorganismo según la reivindicación 3, en el que el microorganismo expresa una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican para una tioesterasa de EC 3.1.2.- o EC 3.1.1.-.

6.

Microorganismo según la reivindicación 3, en el que el microorganismo expresa una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican para una enzima seleccionada de fabB de EC 2.3.1.41, fabK de EC

1.2.1.9, fabL de EC 1.2.1.9, fabM de EC 5.3.3.14, fadE de EC 1.3.99.3 o 1.3.99.-, y combinaciones de las mismas, en el que el derivado de ácido graso está insaturado.

7.

Microorganismo según la reivindicación 1, en el que fadE está atenuado.

8.

Microorganismo según la reivindicación 1, en el que fadD se sobreexpresa.

9.

Microorganismo según la reivindicación 1, en el que el microorganismo está en un recipiente que comprende un caldo de fermentación que comprende al menos 1 mg/l de áster de ácido graso, o al menos 1 mg/l de cera.

Uso del microorganismo según la reivindicación 3, en la producción de un derivado de ácido graso que comprende de desde 1 hasta 5 dobles enlaces.

11.

Uso del microorganismo según la reivindicación 3, en la producción de un derivado de ácido graso que comprende una longitud de cadena de carbono de desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 3.

12.

Uso del microorganismo según la reivindicación 3, en la producción de un derivado de ácido graso que comprende de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 puntos ramificados.

13.

Microorganismo según la reivindicación 1, en el que el microorganismo comprende adicionalmente un éster de ácido graso o cera que tiene un lado A aportado por un alcohol, y un lado B aportado por una acil-CoA.

14.

Microorganismo según la reivindicación 13, en el que el lado A y el lado B se producen por el microorganismo.

Uso del microorganismo según la reivindicación 13, en la producción de un derivado de ácido graso, en el que el lado A, el lado B o tanto el lado A como el lado B de dicho derivado de ácido graso comprenden de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 dobles enlaces.

16.

Uso del microorganismo según la reivindicación 13, en la producción de un derivado de ácido graso, en el que el lado A, el lado B o tanto el lado A como el lado B de dicho derivado de ácido graso comprenden una longitud de cadena de carbono de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 26.

17.

Uso del microorganismo según la reivindicación 13, en la producción de un derivado de ácido graso, en el que el lado A, el lado B o tanto el lado A como el lado B de dicho derivado de ácido graso comprenden de

aproximadamente 1 a aproximadamente 5 puntos de ramificación.

18.

Uso del microorganismo según la reivindicación 13, en la producción de un derivado de ácido graso, en el que el lado A, el lado B o tanto el lado A como el lado B de dicho derivado de ácido graso comprenden entre aproximadamente 1 y 5 restos ciclopropilo.

19.

Microorganismo según la reivindicación 1, en el que el microorganismo es Arthrobacter sp., Bacillus sp., Botryococcus braunii, Chromatium sp., Cladosporíum resina (ATCC22711), Clostridium pasteurianum VKM,

Clostridium tenanomorphum, Clostridium acidiurici, especies de Corynebacterium, especies de cianobacterias (Nostoc muscorum, Anacystis (Synechococcus) nidulans, Phormidium luridum, Chlorogloea fritschii, Trichodesmium erythaeum, Oscillatoria williamsii, Microcoleus chthonoplaseis, Coccochloris elabens, Agmenellum quadruplicatum, Plectonema terebrans, M vaginatus, y C. scopulorum), Desulfovibrio 5 desulfuricans (ATCC29577), Kineococcus radiotolerans (BAA-149), Micrococcus luteus (FD533, ATCC 272,

381, 382, ISU, 54, 4698, 7468, 27141), Micrococcus sp. (ATCC 146, 398, 41, 533), Micrococcus roseus (ATCC 412, 416, 516), Micrococcus lysodeikticus, especies de Mycobacterium, Penicillium sp., Aspergillus sp., Trichoderma virida, Pullularia pullulans, Jeotgalicoccus sp. (M. candicans) (ATCC 8456), Rhodopseudomonas spheroids Chlorobium sp., Rhodospiríllium rubrum (ATCC 1117), Rhodomicrobium 1 vannielii, Stenotrophomonas maltophilia (ATCC 13637, 17444, 17445, 17666, 17668, 17673,17674, 17679,

17677), Saccharomycodes ludwigii (ATCC 22711), Saccharomyces sp. (oviformus, ludwiggi, tropicalis), Vibrio furnissii M1, Vibrio marinus MP-1, Vibrio ponticus, Serratia marinorubra, Ustilago maydis, Ustilago nuda, Urocystis agropyri, Sphacelotheca reiliana o Tilletia sp. (foetida, caries, controversa).

2. Método de producción de un éster de ácido graso que comprende cultivar el microorganismo según una

cualquiera de las reivindicaciones 1-19 en condiciones suficientes para producir un éster de ácido graso; y

separar el éster de ácido graso.

21. Método según la reivindicación 2, en el que el éster de ácido graso es un éster de cera.

22.

23.

24.

Microorganismo según la reivindicación 19, en el que el microorganismo expresa adicionalmente una enzima seleccionada de una alcohol acetiltransferasa de EC 2.3.1.84, una alcohol deshidrogenasa de EC 1.1.1.1 y una acil-CoA reductasa que forma alcohol graso de EC 1.1.1

Microorganismo según la reivindicación 19, en el que el microorganismo expresa una o más secuencias de ácido nucleico que codifican para una enzima seleccionada de uno o más componentes del complejo de la deshidrogenasa de cetoácidos de cadena ramificada de EC 1.2.4.4, //vede EC 2.6.1.42, Ipd de EC 1.8.1.4, ccr de EC 1.1.19, IcmA de EC 5.4.99.2, IcmB de EC 5.4.99.13, fabH de EC 2.3.1.18, ACP de registro NP_626635, fabF de EC 2.3.1.179, fabH3 de EC 2.3.1.18, fabC3 de registro NP_823468, beta-cetoacil- ACP sintasa II de EC 2.3.1.18, enoil-CoA reductasa de EC 1.3.1.34, enoil-CoA isomerasa de EC 4.2.1.-, y combinaciones de las mismas, en el que el derivado de ácido graso está ramificado.

Microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones 19 y 22-23, en el que el microorganismo expresa una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican para una tioesterasa de EC 3.1.2.- o EC 3.1.1.-.

25. Método según la reivindicación 2 ó 21, que comprende además permitir que el derivado de ácido graso se separe en una fase orgánica; y purificar el derivado de ácido graso de la fase orgánica.