Procedimientos de preparación, aislamiento y purificación de epotilona B.

Un procedimiento para aislar epotilona B de un microorganismo productor de epotilona,

que comprende:

(a) fermentar una cepa de un microorganismo productor de epotilona en presencia de una resina queadsorbe epotilona B mediante interacción hidrofóbica;

(b) recoger la resina en un medio a base de agua:

(c) extraer la resina con un disolvente seleccionado para extraer epotilona B y para separarlo del medio abase de agua; y

(d) cristalizar la epotilona B de la fase de extracción antes de una etapa de cromatografía; en el que dichaetapa de fermentación comprende además alimentar con un aditivo capaz de mejorar la cantidad deepotilona B producida en comparación con la cantidad de epotilona A producida y en el que dicho aditivo esuna sal o éster de ácido propiónico.

Procedimientos de preparación, aislamiento y purificación de epotilona B

Solicitudes relacionadas La presente solicitud reivindica el beneficio respecto de la solicitud provisional de EE.UU. con número de serie 60/412.994, presentada el 23 de septiembre de 2002.

Campo de la invención La presente invención se refiere a procedimientos mejorados para la producción, aislamiento y purificación de epotilona B. Estos procedimientos incluyen, por ejemplo, un procedimiento de fermentación para la producción de epotilona B, aislamiento mediante adsorción sobre una resina y la posterior purificación.

Antecedentes de la invención Las epotilonas son una clase relativamente nueva de compuestos macrólidos que se obtuvieron inicialmente mediante fermentación de mixobacterias (Sorangium cellulosum) . Estos compuestos se investigaron inicialmente como agentes protectores de plantas debido a sus propiedades antifúngicas, pero después las epotilonas pasaron a tener interés debido a su actividad citotóxica sobre células animales y posteriormente se caracterizaron como agentes de polimerización de tubulina. Ahora se sabe que las epotilonas ejercen efectos estabilizantes de los microtúbulos similares a los del paclitaxel (TAXOL®) y actividad citotóxica contra las células en rápida proliferación tales como células tumorales u otra enfermedad celular hiperproliferativa. El uso de epotilonas como agentes quimioterapéuticos está descrito por Bollag y col., Cancer Research 55, 2325, 1995.

Las epotilonas A y B (epo A o epo B, respectivamente) tienen las estructuras,

Epotilona A R=H

Epotilona B R=Me Un esquema para obtener las epotilonas lo reveló Höfle y col., en el documento WO 93/10121. Höfle cultivó una cepa de Sorangium cellulosum en un medio que contiene fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y sales minerales. Durante el cultivo de la cepa se añadió una resina de adsorción. Las epotilonas se eluyeron con disolvente desde la resina adsorbente. Las diversas epotilonas se separaron mediante cromatografía de fase inversa y se cristalizaron. No obstante, Höfle y col., concedieron que este procedimiento solo producía una baja cantidad de epotilona B y también que la proporción entre la epotilona B y la epotilona A en la fermentación era baja. Esta baja proporción de epotilona B con respecto a la epotilona A dificulta la recuperación de epotilona B pura. Por tanto, en la técnica existe la necesidad de procedimientos de fermentación mejorados para producir epotilona B frente a epotilona A y mejores procedimientos de aislamiento y purificación de epotilona B.

Además, el documento WO 02/46196 A divulga un procedimiento para desorber epotilonas a partir de una resina, usando dicho procedimiento un disolvente apolar o débilmente polar.

Sumario de la invención La presente invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas. En el presente documento se divulga un procedimiento de fermentación para la producción de epotilona B.

También se divulgan nuevas cepas de Sorangium cellulosum obtenidas mediante mutagénesis para la producción de epotilonas.

También se divulgan procedimientos para mejorar la proporción entre epotilona B y A producidas mediante la nueva cepa de Sorangium cellulosum proporcionando un aditivo a la fermentación. En una realización preferida, el aditivo es propionato, ácido propiónico con un ajuste adecuado del pH u otro precursor del propionato.

También se divulga un procedimiento de extracción mejorado para el aislamiento de la epotilona B del medio de fermentación usando una resina. También se divulgan procedimientos para lavado de la resina rica en epotilona 5 para reducir los niveles de impurezas y un mejor procesamiento corriente abajo.

También se divulga un procedimiento mejorado para la purificación de epotilona B. En una realización, la purificación se consigue usando cristalización. En otra realización, la purificación se consigue mediante procedimientos cromatográficos que incluyen cromatografía de fase normal o cromatografía de fase inversa. En otra realización más, la purificación se consigue mediante una combinación de cristalización y purificación de muestras mediante cromatografía, incluyendo cromatografía de fase normal y de fase inversa. En una realización adicional, el extracto de la resina solo se procesa mediante cristalización.

La epotilona B (“epo B") es útil como intermedio en la preparación del derivado 1 ("d1") (como se describe en la patente de EE.UU. 6.262.094, incorporada en el presente documento por referencia, en la que el 2-metilo sobre el anillo tiazol está sustituido por una amina.

Derivado 1

La epotilona B también es útil en la preparación del derivado 2 ("D2") (la conversión de la lactona de la epotilona B 20 en la lactama del derivado 2 está descrita por Borzilleri y col., J. Amer. Chem. Soc. 122, 8890, 2000, y en el documento WO 99/02514) :

Derivado 2

Adicionalmente, la epotilona B ("epo B") es útil para la preparación del derivado 3 (epotilona D, "D3") (como se describe en la patente de EE.UU. 6.320.045 ) :

Derivado 3

También se divulgan formas en cristal de la epotilona B producidas usando los procedimientos y materiales descritos en la presente memoria.

Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son ejemplos.

Breve descripción de las figuras

Las ventajas, naturaleza y varias características de la invención pueden aparecer más completamente tras consideración de las figuras adjuntas. En las figuras:

La Figura 1 muestra la estructura molecular en la celda unitaria monoclínica de la forma de epoB-EAß, con dos moléculas de epotilona B y dos moléculas de acetato de etilo en el canal invitado de la celda unitaria monoclínica.

La Figura 2 muestra la estructura molecular en la celda unitaria monoclínica de la forma de epoB-ANß, con dos moléculas de epotilona B y dos moléculas de acetonitrilo en el canal invitado de la celda unitaria monoclínica.

La Figura 3 muestra la estructura molecular en la celda unitaria monoclínica de la forma de epoB-Ipß, con dos moléculas de epotilona B y dos moléculas de isopropanol en el canal invitado de la celda unitaria monoclínica.

La Figura 4 muestra la estructura molecular en la celda unitaria monoclínica de la forma de epoB-Toß, con dos moléculas de epotilona B y dos moléculas de tolueno en el canal invitado de la celda unitaria monoclínica.

La Figura 5 muestra patrones de PXRD observados (superior) y simulados (inferior) para el solvato de acetato de etilo (forma cristalina de epoB-EAß) de la epotilona B. En la Figura 5, el patrón simulado se calculó a partir de los parámetros atómicos refinados en la estructura cristalina monoclínica a -33 ºC y el patrón observado se midió a +23° C.

La Figura 6 muestra patrones de PXRD observados (superior) y simulados (inferior) para el solvato de tolueno (forma cristalina de epoB-TOß) de la epotilona B. En la Figura 6, el patrón simulado se calculó a partir de los parámetros atómicos refinados en la estructura cristalina monoclínica a -33 ºC y el patrón observado se midió a +23° C.

La Figura 7 muestra patrones de PXRD observados (superior) y simulados (inferior) para el solvato de acetonitrilo (forma cristalina de epoB-ANß) de la epotilona B. En la Figura 7, el patrón simulado se calculó a partir de los parámetros atómicos refinados en la estructura cristalina monoclínica a -40 ºC y el patrón observado se midió a +23° C.

La Figura 8 muestra patrones de PXRD observados (superior) y simulados (inferior) para el solvato de alcohol isopropílico (forma cristalina de epoB-IPß) de la epotilona B. En la Figura 8, el patrón simulado se calculó a partir de los parámetros atómicos refinados en la estructura cristalina monoclínica a -3 ºC y el patrón observado se midió a +23° C.

La Figura 9 muestra un patrón PXRD observado para un solvato de grado primario que contiene tolueno de la epotilona B producido siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 7, etapa A.

La Figura 10 muestra el análisis térmico (DSC y TGA) para el solvato de grado primario que contiene tolueno de la Figura 9.

La Figura 11 muestra un patrón PXRD observado para un solvato recristalizado que contiene tolueno de la epotilona B producido siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 7, etapa B.

La Figura 12 muestra el análisis térmico (DSC y TGA) para el solvato recristalizado que contiene tolueno de la

Figura 11.

La Figura 13 muestra un patrón PXRD observado para un solvato que contiene acetato de etilo de la epotilona... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para aislar epotilona B de un microorganismo productor de epotilona, que comprende:

(a) fermentar una cepa de un microorganismo productor de epotilona en presencia de una resina que adsorbe epotilona B mediante interacción hidrofóbica;

(b) recoger la resina en un medio a base de agua:

(c) extraer la resina con un disolvente seleccionado para extraer epotilona B y para separarlo del medio a base de agua; y

(d) cristalizar la epotilona B de la fase de extracción antes de una etapa de cromatografía; en el que dicha etapa de fermentación comprende además alimentar con un aditivo capaz de mejorar la cantidad de

epotilona B producida en comparación con la cantidad de epotilona A producida y en el que dicho aditivo es una sal o éster de ácido propiónico.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la epotilona B de la etapa (d) es sustancialmente puro.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la resina es extraida con un disolvente polar.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha etapa de fermentación comprende además fermentar

dicho microorganismo productor de epotilona en presencia de leche desgrasada, harina de soja, extracto de levadura, almidón de maltrina y/o glicerol.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha etapa de fermentación comprende alimentar de forma continua con el aditivo capaz de mejorar la proporción entre la epotilona B y la epotilona A.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho aditivo es propionato sódico, éster metílico de ácido 20 propiónico o éster etílico de ácido propiónico.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende:

(e) al menos una segunda etapa de cristalización eficaz para reducir la cantidad de epotilona A hasta aproximadamente 55% o menos de la cantidad de epotilona A presente después de la etapa de cristalización (d) .

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el microorganismo productor de epotilona es Sorangium cellulosum.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicho microorganismo es la cepa de Sorangium cellulosum en la ACTCC Nº PTA 3880.

10. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicho microorganismo es la cepa de Sorangium cellulosum 30 en la ACTCC Nº PTA 3881.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la resina es un polímero basado en estireno/divinilbenceno.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la resina está presente en un intervalo de aproximadamente 0, 2 e/v % a aproximadamente 5, 0 p/v %.

13. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la resina es XAD-16. 35 14. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha etapa (d) comprende:

(i) la adición de un segundo disolvente en el que la epotilona B no es soluble o es escasamente soluble.

(ii) eliminar al menos una porción del disolvente de extracción; y

(iii) pasar el disolvente resultante o mezcla de disolventes hasta una temperatura a la que la epotilona B cristaliza.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que el disolvente de extracción es acetato de etilo o MTBE, y el segundo disolvente es tolueno.

16. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende:

(f) antes de la etapa (c) lavar la resina con acetonitrilo acuoso, o metanol acuoso, o un medio acuoso que contiene un detergente y un reactivo amina añadido en forma de base, el medio acuoso seleccionado para que no eluya la epotilona B.

17. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende además filtrar por pulido el disolvente que contiene epotilona B.

18. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que microorganismos productores de epotilona producen al

menos 80 mg de epotilona B por litro de caldo o 5 mg de epotilona B por gramo de resina y en el que la 5 epotilona B y la epotilona A se producen en una proporción de epotilona B/A de al menos uno.

19. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la epotilona B y la epotilona A son producidas en una proporción de epotilona B/A de al menos 1, 5.

20. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la epotilona B y la epotilona A son producidas en una proporción de epotilona B/A en el intervalo de 1, 5 a 4, 0.