Procedimiento para la producción por fermentación de productos químicos finos que contienen azufre.

Procedimiento para la producción por fermentación de L-metionina,

que abarca las siguientes etapas:

a) fermentación de un cultivo de bacterias corineformes que producen L-metionina, expresándose en las bacterias corineformes por lo menos una secuencia de nucleótidos, que codifica una proteína con una actividad disminuida de S-adenosil-metionina sintasa (metK) en comparación con la enzima de tipo silvestre, siendo la secuencia codificadora de metK una secuencia de nucleótidos, que codifica una proteína con una actividad disminuida de metK, en la que se ha sustituido por lo menos un resto de cisteína de la proteína de tipo silvestre,

b) enriquecimiento del producto químico fino que contiene azufre en el medio y/o en las células de bacterias, y

c) aislamiento del producto químico fino que contiene azufre, realizándose que la secuencia codificadora de metK es una secuencia codificadora de nucleótidos, que codifica una proteína con actividad de metK, que tiene la siguiente secuencia parcial de aminoácidos:

en la que X1 y X2 representan independientemente entre sí un aminoácido arbitrario;

y X3 representa un aminoácido distinto de Cys introducido por mutación.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2003/005423.

Solicitante: EVONIK DEGUSSA GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: RELLINGHAUSER STRASSE 1-11 45128 ESSEN ALEMANIA.

Inventor/es: KROGER, BURKHARD, SCHRODER, HARTWIG, ZELDER, OSKAR, HAFNER,STEFAN, KLOPPROGGE,Corinna.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N1/21 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/09 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12N9/10 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22).
  • C12P13/12 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 13/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno. › Metionina; Cisteína; Cistina.
  • C12R1/15 C12 […] › C12R SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C - C12Q, RELATIVO A LOS MICROORGANISMOS.C12R 1/00 Microorganismos. › Corynebacterium.

PDF original: ES-2383888_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Procedimiento para la producción por fermentación de productos químicos finos que contienen azufre Es objeto del invento un nuevo procedimiento para la producción por fermentación de L-metionina, en cuyo caso se aprovechan unas bacterias, en las que se expresan unas secuencias de nucleótidos, que codifican mutantes de la Sadenosil-metionina sintasa (metK) (E.C.2.5.1.6) ; unas secuencias de nucleótidos, que codifican estos mutantes, así como los microorganismos recombinantes transformados con éstos, así como nuevos mutantes de la metK con una actividad enzimática modificada.

Estado de la técnica

Unos productos químicos finos que contienen azufre, tales como, por ejemplo, metionina, homocisteína, S-adenosilmetionina, glutatión, cisteína, biotina, tiamina y ácido lipónico, se producen en células por medio de procesos metabólicos naturales, y se utilizan en muchos ramales industriales, inclusive las industrias alimentaria, de piensos, cosmética y farmacéutica. Estas sustancias, que son designadas en común como "productos químicos finos que contienen azufre", abarcan ácidos orgánicos, aminoácidos tanto proteinógenos como también no proteinógenos, vitaminas y cofactores. Su producción se efectúa de la manera más conveniente a gran escala mediante cultivación de unas bacterias, que habían sido desarrolladas para producir y segregar grandes cantidades de la sustancia deseada en cada caso. Unos organismos especialmente adecuados para esta finalidad son las bacterias corineformes gram positivas, no patógenas.

Es conocido el hecho de que ciertos aminoácidos pueden ser producidos por fermentación de cepas de bacterias corineformes, en particular de Cor y nebacterium glutamicum. A causa de la gran importancia de esto, se está trabajando constantemente en el mejoramiento de los procedimientos de producción. Ciertos mejoramientos de los procedimientos pueden implicar a medidas técnicas de fermentación, tales como por ejemplo las de agitación y abastecimiento con oxígeno, o a la composición de los medios nutritivos, tal como por ejemplo la concentración de azúcares durante la fermentación, o al tratamiento para dar el producto, por ejemplo mediante una cromatografía con intercambio de iones, o a las propiedades intrínsecas de rendimiento del microorganismo propiamente dicho.

A través de una selección de cepas se han desarrollado una serie de cepas mutantes, que producen una gama de compuestos deseables escogidos entre la serie de los productos químicos finos que contienen azufre. Para el mejoramiento de las propiedades de rendimiento de estos microorganismos en lo que respecta a la producción de una determinada molécula, se utilizan métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes. No obstante, esto constituye un procedimiento largo, tedioso y difícil. de esta manera se obtienen p.ej. unas cepas, que son resistentes frente a ciertos antimetabolitos, tales como p.ej. los compuestos análogos a metionina α-metil-metionina, etionina, norleucina, N-acetil-norleucina, S-trifluorometil-homocisteína, ácido 2-amino-5-hepteno-carboxílico, selenometionina, metionina-sulfoximina, metoxina, ácido 1-amino-ciclopentano-carboxílico, o que son auxótrofas para ciertos metabolitos importantes para regulación, y producen productos químicos finos que contienen azufre, tales como p.ej. L-metionina.

Desde hace algunos años se están empleando asimismo unos métodos de la técnica de ADN recombinante para el mejoramiento de las cepas, particularmente de cepas de Cor y nebacterium que producen L-aminoácidos, amplificando genes individuales para la biosíntesis de aminoácidos e investigando la repercusión sobre la producción de aminoácidos.

A partir del documento de solicitud de patente japonesa JP-A-06-020809 se conoce una secuencia de nucleótidos para un gen que codifica S-adenosil-metionina procedente de Brevibacterium flavum MJ-233, que es una bacteria corineforme. La correspondiente secuencia de aminoácidos abarca 412 aminoácidos. La proteína tiene, entre otros lugares en las posiciones 24 y 94, en cada caso sendos restos de cisteína, que están conservados en las correspondientes enzimas de otras numerosas bacterias corineformes. La secuencia divulgada de aminoácidos posee un segmento de secuencia característico entre los radicales 137 y 154. La producción de mutantes y la utilización de éstos en el caso la producción por fermentación de productos químicos finos que contienen azufre, no se describen allí.

A partir del documento de solicitud de patente internacional WO-A-01/00843 se conoce un gen metK procedente de C. glutamicum, que codifica una proteína con 407 aminoácidos y tiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO:16.

Ciertos mejoramientos de la producción por fermentación de productos químicos finos se correlacionan por regla general con ciertos mejoramientos de los flujos de sustancias y de los rendimientos. En este contexto es importante impedir o disminuir unas inhibiciones por productos intermedios o finales de importantes enzimas de síntesis. Asimismo, es ventajoso impedir o disminuir fugas del flujo de carbono en productos indeseados o en productos secundarios.

Puede ser investigada la influencia de ciertos metabolitos del metabolismo sobre las actividades enzimáticas de enzimas del metabolismo. Ejemplos de tales enzimas pueden ser metA, metB, metC, MetY, metH, metE, metF y otras enzimas que participan en el metabolismo de microorganismos. Un importante producto del metabolismo de la metionina y, por consiguiente, una esencial fuga, es la S-adenosil-metionina.

Al mismo tiempo, la S-adenosil-metionina es, no obstante, también una sustancia reguladora decisiva de la biosíntesis de metionina. Por ejemplo, se conoce el hecho de que la biosíntesis de L-metionina en E. coli es inhibida por la S-adenosil-metionina. La S-adenosil-metionina actúa allí como un co-represor del represor metJ (Weissbach, H. Brot, N. (1991) Mol Microbiol. 5 (7) , 1593-1597) .

La síntesis de la S-adenosil-metionina constituye al mismo tiempo una fuga esencial del producto valioso deseado Lmetionina. Por lo tanto, por varios motivos, es deseable disminuir la cantidad de la S-adenosil-metionina formada: a) se aumentaría la cantidad de la L-metionina formada, b) se disminuiría la represión de genes de la biosíntesis de metionina y c) se disminuiría la inhibición por retroalimentación (feedback) de enzimas de la biosíntesis de metionina.

La supresión (deleción) del gen metK sería la vía más sencilla para impedir la formación de S-adenosil-metionina. En la cita de Wei, Y. y Newman, E. B. (2002) Mol. Microbiol. 43 (6) , 1651-1656, el metK ha sido descrito, sin embargo, como un gen esencial y parece descartarse por consiguiente para un experto en la especialidad como un punto de partida para realizar una mejorada producción por fermentación de productos químicos finos que contienen azufre, en particular de L-metionina.

GROSSMANN K Y COLABORADORES: en "Rapid cloning of metK encoding methionine adenosyltransferase from Cor y nebacterium glutamicum by screening a genomic librar y on a high density colony-array" [Clonación rápida de metK, que codifica la metionina adenosil transferasa de Cor y nebacterium glutamicum, mediante escrutinio de una biblioteca de genes en un conjunto de colonias de alta densidad], FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, tomo 193, n° 1, 1 de diciembre de 2000, páginas 99-103, divulgan tanto la secuencia de nucleótidos codificadora de metK procedente de Cor y nebacterium glutamicum, como también la expresión de la misma en C. glutamicum. Sin embargo, la secuencia de nucleótidos no codifica un polipéptido con una actividad disminuida de metK.

RECZKOWSKI R S Y COLABORADORES: en "Structural and functional roles of cysteine 90 and cysteine 240 in Sadenosylmethionine synthetase" [Cometidos estructurales y funcionales de la cisteína 90 y de la cisteína 240 en la S-adenosil-metionina sintasa], THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, tomo 270, n° 31, 4 de agosto de 1995, páginas 18484-18490, describen unos mutantes de metK con una actividad disminuida de metK, en las que la Cys90, perteneciente a la secuencia parcial de aminoácidos GFDANSCA de metK de Escherichia coli, ha sido reemplazada por Ala o Ser, al igual que para unos polinucleótidos y unas construcciones artificiales de expresión que codifican C90A/S-MetK.

KASE H Y COLABORADORES: en "Isolation and characterization of S-adenosylmethionine-requiring mutants and role of S-adenosylmethionine in the regulation of methionine biosynthesis in Cor y nebacterium... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento para la producción por fermentación de L-metionina, que abarca las siguientes etapas:

a) fermentación de un cultivo de bacterias corineformes que producen L-metionina, expresándose en las bacterias corineformes por lo menos una secuencia de nucleótidos, que codifica una proteína con una actividad disminuida de S-adenosil-metionina sintasa (metK) en comparación con la enzima de tipo silvestre, siendo la secuencia codificadora de metK una secuencia de nucleótidos, que codifica una proteína con una actividad disminuida de metK, en la que se ha sustituido por lo menos un resto de cisteína de la proteína de tipo silvestre, b) enriquecimiento del producto químico fino que contiene azufre en el medio y/o en las células de bacterias, y c) aislamiento del producto químico fino que contiene azufre, realizándose que la secuencia codificadora de metK es una secuencia codificadora de nucleótidos, que codifica una proteína con actividad de metK, que tiene la siguiente secuencia parcial de aminoácidos:

en la que X1 y X2 representan independientemente entre sí un aminoácido arbitrario;

y X3 representa un aminoácido distinto de Cys introducido por mutación.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, realizándose que la secuencia codificadora de metK codifica una proteína con actividad de metK, abarcando la proteína una secuencia de aminoácidos de desde Met1 hasta Ala407 de acuerdo con la SEQ ID NO: 22.

3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, realizándose que la secuencia codificadora de metK es un ADN o un ARN replicable en bacterias corineformes o integrado de una manera estable en el cromosoma.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, realizándose que

a) se emplea una cepa de bacterias transformada con un vector plasmídico, que lleva por lo menos una copia de la secuencia de metK mutada bajo el control de secuencias reguladoras, o b) se emplea una cepa, en la que la secuencia de metK mutada se había integrado en el cromosoma de la bacteria.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, realizándose que se fermentan unas bacterias corineformes, en las que se ha sobreexpresado al mismo tiempo por lo menos uno de los genes, que se escoge entre a) el gen lysC, que codifica una aspartato cinasa, b) el gen asd, que codifica una asparato-semialdehído deshidrogenasa, c) el gen gap, que codifica la glicerolaldehído-3-fosfato deshidrogenasa, d) el gen pgk, que codifica la 3-fosfoglicerato cinasa, e) el gen pyc, que codifica la piruvato carboxilasa, f) el gen tpi, que codifica la triosafosfato isomerasa, g) el gen metA, que codifica la homoserina O-acetiltransferasa, h) el gen metB, que codifica la cistationina-gamma sintasa, i) el gen metC, que codifica la cistationina-gamma liasa, j) el gen metH, que codifica la metionina sintasa, k) el gen glyA, que codifica la serina hidroximetiltransferasa, l) el gen metY, que codifica la O-acetil-homoserina sulfhidrilasa, m) el gen metF, que codifica la metilentetrahidrofolato reductasa, n) el gen serC, que codifica la fosfoserina aminotransferasa, o) el gen serB, que codifica la fosfoserina fosfatasa,

p) el gen cysE, que codifica la serina acetil-transferasa, q) el gen cysK, que codifica la cisteína sintasa, r) el gen hom, que codifica la homoserina deshidrogenasa; y/o en las que se ha mutado al mismo tiempo por lo menos uno de estos genes, de tal manera que la correspondiente proteína, comparada con la proteína no mutada, sea influida en su actividad en una más pequeña medida o ya no sea influida por un metabolito del metabolismo, o que sea aumentada su actividad específica.

6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, realizándose que se fermentan unas bacterias corineformes, en las que se ha debilitado al mismo tiempo por lo menos uno de los genes, que se escoge entre a) el gen thrB, que codifica la homoserina cinasa, b) el gen ilvA, que codifica la treonina deshidratasa, c) el gen thrC, que codifica la treonina sintasa, d) el gen ddh, que codifica la meso-diaminopimelato D deshidrogenasa, e) el gen pck, que codifica la fosfoenolpiruvato carboxicinasa, f) el gen pgi, que codifica la glucosa-6-fosfato 6-isomerasa, g) el gen poxB, que codifica la piruvato oxidasa, h) el gen dapA, que codifica la dihidropicolinato sintasa, i) el gen dapB, que codifica la dihidropicolinato reductasa; o j) el gen lysA, que codifica la diaminopicolinato descarboxilasa; y/o realizándose que se fermentan unas bacterias corineformes, en las que se ha mutado al mismo tiempo por lo menos uno de estos genes de tal manera que la actividad enzimática de la correspondiente proteína sea disminuida parcial o completamente.

7. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones anteriores, realizándose que se emplean microorganismos de la especie Cor y nebacterium glutamicum.

8. Procedimiento para la producción de un aditivo en piensos para animales que contiene L-metionina a partir de caldos de fermentación, que abarca las siguientes etapas

a) cultivación y fermentación de un microorganismo, que produce L-metionina, de acuerdo con la definición dada en una de las reivindicaciones anteriores, en un medio de fermentación;

b) eliminación de agua a partir del caldo de fermentación que contiene L-metionina;

c) eliminación de la biomasa formada durante la fermentación en una proporción de 0 a 100 % en peso; y d) desecación del caldo de fermentación obtenido de acuerdo con b) y/o c) , con el fin de obtener el aditivo en piensos para animales en la deseada forma de un polvo o granulado.

Fig. 1

Ensayo de metK

período de tiempo [min]


 

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