PROCEDIMIENTO DE DETECCIÓN DE COLAPSO CANINO INDUCIDO POR EL EJERCICIO.

Procedimiento de detección de colapso canino inducido por el ejercicio Antecedentes de la invención Las enfermedades del sistema nervioso son responsables de una proporción significativa de los problemas sanitarios humanos. Se han documentado mutaciones genéticas de varias formas importantes de enfermedad neurológica, incluyendo epilepsias y neuropatías. Debido al nexo humano-animal, los animales de compañía tienen una vigilancia sanitaria solo aventajada por la humana, haciendo de los animales de compañía, y de los perros en particular, modelos ideales para muchas afecciones sanitarias. Los modelos caninos han ayudado a definir la base molecular y el tratamiento de una serie de enfermedades neurológicas incluyendo narcolepsia, enfermedad de Lafora y enfermedad de almacenamiento lisosómico. Aunque la fisiología de los neurotransmisores y sus receptores respectivos se ha detallado extensamente durante décadas, la biología de las vesículas sinápticas neurotransmisoras y las proteínas asociadas está solo empezando a elucidarse. La dinamina 1 (DNM1) es importante de forma crítica para el reciclado de vesículas sinápticas durante la estimulación neurológica a alto nivel. Los cobradores de labrador (Labrador Retriever) son la raza de perro más común del mundo, con más de 123.760 nuevos registros en EE.UU. solo en 2006. Durante los últimos 100 años, con la aparición de los clubes cinológicos, las exposiciones caninas y los estándares de crianza canina muy específicos, la endogamia en razas de perro ha aumentado drásticamente. Se han documentado más de 370 enfermedades mendelianas en perros, con más de un 70% de ellas recesivas autosómicas y un 46% específicas de raza. La alta especificidad de raza es debida lo más probablemente a las mutaciones recesivas nocivas que se propagan y concentran por el efecto fundador o por criar repetidamente sementales populares. El colapso inducido por el ejercicio (CIE) es un síndrome recién caracterizado en perros. La afección se ha descrito mejor en cobradores de labrador, pero es conocido que perros de una serie de otras razas tienen una afección similar. Los perros que se considera que padecen CIE empiezan a desarrollar signos de un episodio habitualmente 5-15 minutos después del inicio de un ejercicio vigoroso de alta excitación tal como cobrar muñecos de entrenamiento o pájaros. Al inicio del episodio de CIE, el perro empieza a perder coordinación y desarrolla un paso tambaleante que pronto evoluciona a la pérdida del control de las patas traseras. A veces, el episodio afecta a todo el cuerpo, siendo el perro incapaz de moverse. El episodio de colapso dura habitualmente 5-10 minutos, y después de 30 minutos el perro se habrá recuperado casi completamente. El CIE afecta a perros que parecen estar típicamente en excelente condición física y que habitualmente tienen muy buen tono muscular, lo que es diferente de muchas otras causas de intolerancia al ejercicio. A partir del artículo de Internet "EXERCISE INDUCED COLLAPSE IN LABRADOR RETRIEVERS" de Susan M. Taylor (01-03-2008, XP-002544723) recuperado de http://www.thelabradorclub.com/uploads/file/Exercise%20Induce%20Collapse.pdf, es conocido que el CIE está causado por una mutación recesiva autosómica que podría detectarse para determinar la predisposición al CIE. Sin embargo, el artículo no proporciona ningún detalle de dónde está localizada la mutación o de cómo puede detectarse en la práctica. Sumario de la invención La presente invención caracteriza ensayos para determinar su un perro tiene o es susceptible de desarrollar colapso inducido por el ejercicio (CIE). En una realización, el procedimiento comprende determinar si está presente un alelo asociado con la enfermedad en un ácido nucleico del sujeto. En ciertas realizaciones, el alelo es de dinamina 1 (G767T) en la SEQ-ID-No. 1. La detección del alelo de dinamina 1 (G767T) es indicativa de que el perro tiene o está predispuesto al desarrollo de CIE. Los alelos apropiados pueden detectarse mediante cualquiera de una variedad de medios, incluyendo: 1) efectuar una reacción de hibridación entre la muestra de ácido nucleico y una sonda o sondas que sean capaces de hibridación con el alelo; 2) secuenciar al menos una porción del alelo; o 3) determinar la movilidad electroforética del alelo o un componente del mismo. En una realización, el alelo se somete a una etapa de amplificación antes o junto con la práctica de la etapa de detección. En ciertas realizaciones, las etapas de amplificación son reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), clonación y variaciones de las anteriores (por ejemplo, PCR-FI y amplificación específica de alelo). En una realización, la muestra se hibrida con un conjunto de cebadores que hibridan en 5 y 3 con una secuencia codificante o anticodificante de un alelo y se somete a amplificación por PCR. En una realización, la etapa de detección es una hibridación específica de alelo seguida de una extensión específica de cebador. En una realización, antes o junto con la detección, se somete la muestra de ácido nucleico a una etapa de amplificación. En una realización, el análisis de tamaño es precedido por una digestión con enzima de restricción. En una realización, se amplifica dinamina 1 o una porción de la misma. En una realización, se inmoviliza al menos una sonda oligonucleotídica sobre una superficie sólida. 2   En otro aspecto, la invención caracteriza kits para efectuar los ensayos anteriormente descritos. El kit puede incluir la recogida de muestras de ADN y un medio para determinar un alelo que es indicativo de CIE en un perro. En una realización, el kit contiene un primer oligonucleótido cebador que hibrida en 5 o 3 con un alelo de dinamina 1 (G767T) en la SEQ-ID-No. 1. En una realización, el kit comprende adicionalmente un segundo oligonucleótido cebador que hibrida en 3 o 5 respectivamente con el alelo, de modo que el alelo puede amplificarse mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En una realización, el primer cebador y el segundo cebador hibridan con una región en el intervalo de aproximadamente 50 a aproximadamente 1000 pares de bases. En una realización, el kit comprende adicionalmente un medio de detección. En ciertas realizaciones, el medio de detección es mediante a) hibridación específica de alelo; b) análisis de tamaño; c) secuenciación; d) hibridación; e) digestión con nucleasa 5; f) polimorfismo de conformación monocatenaria; g) extensión específica de cebador y/o h) ensayo de ligamiento de oligonucleótidos. En ciertas realizaciones, el kit comprende adicionalmente un medio de amplificación. La información obtenida usando los ensayos y kits descritos en la presente memoria es útil para determinar si un perro tiene o es susceptible de desarrollar CIE. Además, la información permite la personalización de la terapia según el perfil genético del perro. La presente invención proporciona un procedimiento para la detección de la presencia de un biomarcador asociado con colapso canino inducido por el ejercicio (CIE). En una realización de la invención, el procedimiento implica obtener una muestra fisiológica de un perro, en el que la muestra comprende ácido nucleico, y determinar la presencia del biomarcador. Como se usa en la presente memoria, la frase muestra fisiológica pretende designar una muestra biológica obtenida de un mamífero que contiene ácido nucleico. Por ejemplo, una muestra fisiológica puede ser una muestra recogida de un perro individual tal como incluyendo, pero sin limitación, por ejemplo una muestra celular tal como una célula sanguínea, por ejemplo un linfocito o una célula de sangre periférica; una muestra de tejido tal como una muestra de mucosa (por ejemplo, frotis bucal) o tejido muscular, por ejemplo, músculo esquelético; una muestra de órgano, por ejemplo hígado o piel; una muestra de cabello, por ejemplo una muestra de cabello con raíces; y/o una muestra de fluido tal como sangre. Los ejemplos de razas de perros afectados incluyen, pero sin limitación, cobradores de labrador, cobradores de la bahía de Chesapeake (Chesapeake Bay Retriever), cobradores de pelo rizado (Curly-Coated Retriever), pastores escoceses (Border Collies), u otras razas relacionadas o no relacionadas. El procedimiento de la presente invención incluye también perros de razas cruzadas o mixtas. La presente invención proporciona además un procedimiento para determinar si un perro tiene o está predispuesto a desarrollar colapso inducido por el ejercicio (CIE) que implica (a) transportar una muestra biológica desde un perro sospechoso de tener o de estar predispuesto a desarrollar CIE hasta un laboratorio de diagnóstico, (b) detectar en una muestra de ácido nucleico del perro un alelo asociado al... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la determinación de si un perro tiene o está predispuesto a desarrollar colapso inducido por el ejercicio (CIE), que comprende la etapa de detectar en una muestra de ácido nucleico del perro un alelo G767T de dinamina 1 asociado a CIE en la SEQ-ID-No. 1, en el que la detección del alelo G767T de dinamina 1 es indicativa de que el perro tiene o está predispuesto al desarrollo de CIE. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que antes o junto con la detección, se somete la muestra de ácido nucleico a una etapa de amplificación. 3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que se amplifica la dinamina 1 o una porción de la misma. 4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la etapa de detección es mediante a) hibridación específica de alelo; b) análisis por tamaño; c) secuenciación; d) hibridación; e) digestión con nucleasa 5; f) polimorfismo de conformación monocatenaria; g) extensión específica de cebador y/o h) ensayo de ligamiento oligonucleotídico. 5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el análisis por tamaño es precedido por una digestión con enzima de restricción. 6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que al menos una sonda oligonucleotídica específica del alelo de dinamina 1 (G767T) se inmoviliza sobre una superficie sólida. 7. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el perro es un cobrador de labrador, un cobrador de la bahía de Chesapeake, un cobrador de pelo rizado o un pastor escocés. 8. Un kit para determinar la existencia o la susceptibilidad de desarrollar colapso inducido por el ejercicio (CIE) en un perro, comprendiendo el kit un primer oligonucleótido que hibrida en 5 o 3 con un alelo de dinamina 1 (G767T) en la SEQ-ID-No. 1 y que comprende adicionalmente un segundo oligonucleótido cebador que hibrida en 3 o 5 respectivamente con el alelo, de modo que el alelo puede amplificarse mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 9. El kit de la reivindicación 8, en el que el primer cebador y el segundo cebador hibridan con una región en el intervalo de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 1000 pares de bases. 10. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, que comprende adicionalmente un medio de detección. 11. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que comprende adicionalmente un medio de amplificación. 28   Figura 1 29   Figura 2 Figura 3   Figura 4 31   Figura 5A 32   Figura 5B 33   34 Figura 7A   Secuencia del producto Cebador inverso Tamaño del producto Par cebador Cebador de codificación 599 Exón 1 Exón 2 452 Exón 3 243 Exón 4 Figura 7B   Exón Secuencia de exón predicha Secuencias de sitio de corte y empalme predichas Polimorfismos y comentarios 1 Existen dos posibles codones de inicio en fase 2 SNP 1 del intrón 1, 2 perros afectados son A/A, 1 perro no afectado es G/G, el ensamblaje genómico es G/G; SNP 2 del intrón 2, 2 perros afectados y 1 perro no afectado son G/G y el ensamblaje genómico es C/C 36 3 4 Figura 7C   Secuencia del producto Cebador inverso Tamaño del producto Par cebador Cebador de codificación 581 Exones 5 y 6 Exones 7, 8 y 9 37 Figura 7D   Exón Secuencia de exón predicha Polimorfismos y comentarios Secuencias de sitio de corte y empalme predichas SNP1 del exón 5, 2 perros afectados son T/T, 1 no afectado es C/T, el ensamblaje genómico es T/T; SNP2 del exón 5, 2 perros afectados son C/C, 1 perro no afectado es C/T, el ensamblaje genómico es C/C; SNP1 del exón 6, 12 perros afectados son C/C, 1 perro no afectado es C/T, 3 perros no afectados son C/C, 8 perros no afectados son C/T, el ensamblaje genómico es C/C; SNP2 del exón 6, 12 perros afectados son T/T, 6 perros no afectados son G/G, 6 perros no afectados son G/T, el ensamblaje genómico es G/G (mutación CIE); SNP1 del intrón 6, 12 perros afectados son C/C, 3 perros no afectados son C/C, 1 perro no afectado es T/T, 8 perros no afectados son C/T, el ensamblaje genómico es C/C 38 6 7 SNP del intrón 7 justo 5 del inicio del exón 8; SNP2 del exón 8, 2 perros afectados son G/G, 1 perro no afectado es G/G, el ensamblaje genómico es C/C 8 9 El sitio no GT (concretamente GC) está también presente en seres humanos Figura 7E   Secuencia del producto Tamaño del producto Cebador inverso Par cebador Cebador de codificación Exón 1 549 Exón 11 39 Exón 12 Exón 13 y 14 Figura 7F   Exón Secuencia de exón predicha Polimorfismos y comentarios Secuencias de sitio de corte y empalme predichas SNP2 del intrón 10, 2 perros afectados son G/G, 1 perro no afectado es G/A, el ensamblaje genómico es G/G 11 SNP1 del intrón 11, 2 perros afectados son C/C, 1 perro no afectado es C/T, el ensamblaje genómico es T/T; SNP2 del intrón 11, ins/del en la secuencia ttttttttt 12 SNP2 del intrón 11, 2 perros afectados son C/C, 1 perro no afectado es C/C, el ensamblaje genómico es T/T; microsatélite de repetición GT en el intrón 12 13 14 Figura 7G   Secuencia del producto Cebador inverso Tamaño Par cebador Cebador de del producto codificación 529 Exón 15 474 Exón 16 41 501 Exón 17 194 Exón 18 367 Exón 19   42 Figura 7H   Exón Secuencia de exón predicha Polimorfismos y comentarios Secuencias de sitio de corte y empalme predichas SNP del intrón 15, ins/del múltiples en la secuencia 3 ttttttttt 16 SNP del intrón 15, 2 perros afectados son T/T, 1 perro no afectado es C/C, el ensamblaje genómico es C/C 17 SNP2 del exón 17, 2 perros afectados son A/A, 1 perro no afectado es G/G, el ensamblaje genómico es A/A 43 18 SNP del intrón 17, 2 perros afectados son G/G, 1 perro no afectado es A/G, el ensamblaje genómico es G/G; SNP del intrón 18, 2 perros afectados son G/G, 1 perro no afectado es T/G, el ensamblaje genómico es G/G 19 SNP1 del intrón 18, 2 perros afectados son C/C, 1 perro no afectado es T/T, el ensamblaje genómico es C/C; SNP2 del intrón 18, 2 perros afectados son G/G, 1 perro no afectado es A/A. el ensamblaje genómico es G/G; SNP2 del intrón 19, 2 perros afectados son C/C, 1 perro no afectado es C/T, el ensamblaje genómico es C/C Figura 7I   Secuencia del producto Cebador inverso Tamaño del producto Par cebador Cebador de codificación Exón 20 596 Exón 21 (5) 353 Exón 21 (3) 44 206 Exón 22, extremo alternativo 337 Exón 6 para genotipado   Figura 7J Exón Secuencia de exón predicha Polimorfismos y comentarios Secuencias de sitio de corte y empalme predichas 21 Extr. Altern. Para preparar la forma larga, se rompe el exón 21 en AG GTGA cerca del extremo 3 de la secuencia codificante y se corta y empalma con este extremo alternativo la secuencia después de su 5ag. El transcrito más largo usa el GT de la forma corta como señal de sitio de corte y empalme para conectar con la secuencia codificante del extremo alternativo en dirección 3 de ag 6 SNP1 del exón 6, los no afectados son Y (C/T), Tasha es C; SNP2 del exón 6, los no afectados son G, los afectados son T (mutación de CIE)   Figuras 8A-8C 46   Figura 9 47