Procedimiento y composiciones para detectar específicamente moléculas poliméricas fisiológicamente aceptables.

Un procedimiento para la determinación del número de moléculas poliméricas solubles en agua unidas a una proteína o a un complejo proteico en un conjugado de polímero-proteína, que comprende las etapas de

detectar la unión entre

(i) un conjugado de polímero-proteína con uno o más polímeros unidos a la proteína, y

(ii) un anticuerpo que se une específicamente a dicho polímero, siendo dicho anticuerpo detectable cuando está unido a dicho conjugado de polímero-proteína,

en el que el número de polímeros del conjugado de polímero-proteína se correlaciona con los niveles de anticuerpo detectado unido al conjugado de polímero-proteína cuando se compara con un control conocido.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E11177227.

Solicitante: BAXTER INTERNATIONAL INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: ONE BAXTER PARKWAY DEERFIELD, IL 60015 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: TURECEK, PETER, WEBER, ALFRED, SIEKMANN, JURGEN, DR., VARADI, KATALIN, GRITSCH, HERBERT, VEJDA,SUSANNE.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/53 (Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/68 (en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos)

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Procedimiento y composiciones para detectar específicamente moléculas poliméricas fisiológicamente aceptables.

Fragmento de la descripción:

Procedimiento y composiciones para detectar específicamente moléculas poliméricas fisiológicamente aceptables Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para determinar la cantidad de una molécula polimérica soluble en agua unida a una proteína.

Antecedentes de la invención

La función in vivo de una proteína se mejora uniéndola a una molécula polimérica fisiológicamente aceptable. En particular, se ha encontrado que la unión de una proteína fisiológicamente activa a una molécula polimérica fisiológicamente aceptable prolonga sustancialmente su semivida in vivo. Por ejemplo, la Patente de EE.UU. 4.970.300 describe que la conjugación de una molécula polimérica fisiológicamente aceptable al factor VIII da como resultado una proteína de factor VIII que puede ser activada por la trombina y que tiene una antigenicidad y una ¡nmunorreactividad sustancialmente disminuidas, y un tiempo de desaparición in vivo sustancialmente aumentado en el torrente sanguíneo de un mamífero.

La Patente de EE.UU. 4.970.300 describe que la conjugación de una molécula polimérica (dextrano) al Factor VIII (FVIII) da como resultado una proteína de FVIII que puede ser activada por la trombina y que tiene una antigenicidad y una ¡nmunorreactividad sustancialmente disminuidas, y un tiempo de desaparición in vivo sustancialmente aumentado en el torrente sanguíneo de un mamífero. La solicitud de patente internacional W094/15625 describe que la conjugación del factor VIII a una molécula polimérica fisiológicamente aceptable mejora la función in vivo del factor VIII (i) aumentando su resistencia a la hidrólisis in vivo, y prolongando su actividad después de su administración, (ii) prolongando significativamente su vida circulante in vivo con respecto a la proteína no modificada, y (iii) aumentando su tiempo de absorción en el torrente sanguíneo. La Patente de EE.UU. 6.037.452 describe conjugados de FVIII y de Factor IX (FIX) en los que la proteína está unida covalentemente a un óxido de polialquileno a través de grupos carbonilo en la proteína. Además, se ha descrito la mejora de la función in vivo del factor IX mediante su unión a moléculas poliméricas fisiológicamente aceptables, en particular, polietilenglicol ("PEG"), en la solicitud de patente internacional WO94/29370. Se desveló un FVIII PEGilado que conserva su actividad específica en la Publicación de Patente Internacional WO/2007/126808. La conjugación de un polímero fisiológicamente aceptable con un agente activo tal como una proteína se realiza preparando conjugados estables de polímero-proteína o conjugados de polfmero-proteína en los que el polímero fisiológicamente aceptable está unido a la proteína a través de conectares covalentes escindibles (concepto de profármaco), es decir, un conectar hidrolizable o escindible. Por ejemplo, se ha desarrollado una fracción de PEG escindióle usando un sistema de conjugación con 9-flourenometoxicarbonilo (FMOC) que contiene dos cadenas de PEG (Nektar Inc., Huntsville AL). Además, un grupo éster de N-hidroxisuccinimida (NHS), que es útil para la modificación química de residuos de Usina de la proteína, puede estar unido al sistema anular de fluoreno a través del grupo metoxicarbonilo para generar la fracción escindible de PEG. La Publicación de Patente Internacional W02008/082669 (incorporada en este documento como referencia) describe una serie de variantes PEGiladas del FVIII recombinante basadas en el concepto de PEG escindible.

Sin embargo, actualmente no hay disponible un procedimiento fiable para la determinación cuantitativa de moléculas poliméricas fisiológicamente aceptables unidas a proteínas o nanopartículas, aparte de los imprecisos procedimientos colorimétricos (Nag y col. 1997, Anal Biochem 250: 35 - 43), que sólo permiten una estimación del contenido de moléculas poliméricas fisiológicamente aceptables. Además, se han desvelado anticuerpos monoclonales para la determinación de las concentraciones de PEG (patente de EE.UU. 6.617.118), pero hasta ahora no hay disponible un sistema para la determinación fiable de la cantidad de molécula polimérica fisiológicamente aceptable unida a una proteína.

Por lo tanto, existe la necesidad de un nuevo sistema para determinar la cantidad de una molécula polimérica soluble en agua, en particular de PEG, unida a una proteína, particularmente a una proteína fisiológicamente activa.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para determinar la cantidad de una molécula polimérica soluble en agua unida a una proteína. Adicionalmente, se da a conocer un anticuerpo capaz de unirse específicamente a una molécula polimérica fisiológicamente aceptable en el que, por ejemplo, dicha molécula polimérica está presente unida a una proteína. Además, la presente invención se refiere al uso de dicho anticuerpo para la determinación de la cantidad de una molécula polimérica soluble en agua unida a una proteína.

En un aspecto, se da a conocer un procedimiento para la determinación de la cantidad de una molécula polimérica fisiológicamente aceptable unida a una proteína, que comprende las etapas de (a) proporcionar al menos una proteína unida a al menos una molécula polimérica fisiológicamente aceptable; (b) proporcionar al menos un anticuerpo capaz de unirse específicamente a dicha molécula polimérica fisiológicamente aceptable; (c) poner en

contacto el anticuerpo de la etapa (b) con la proteína de la etapa (a) en unas condiciones adecuadas para la unión de dicho anticuerpo a la al menos una molécula polimérica unida a dicha proteína; y (d) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo y la molécula polimérica fisiológicamente aceptable.

En una forma de realización, en la etapa (a) la proteína unida a la al menos una molécula polimérica fisiológicamente aceptable está Inmovilizada sobre un sustrato o una matriz portadora.

En una forma de realización adicional, el anticuerpo se elige del grupo que consiste en un anticuerpo policlonal y un

anticuerpo monoclonal.

En otra forma de realización, la proteína es el factor de von Willebrand (VWF) o un derivado del mismo. En una forma de realización adicional, la proteína es el Factor VIII o un derivado del mismo.

En algunas formas de realización, la molécula polimérica fisiológicamente aceptable se elige del grupo que consiste en polialquilenglicol, polipropilenglicol, copolfmeros de etilenglicol y propilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol poliolefínico, polivinilpirrolidona, polihidroxialquilmetacrilamida, polihidroxialquilmetacrilato, polisacáridos, poli-a- hidroxiácido, alcohol polivinílico, polifosfasfaceno, polioxazolina y poli-N-acriloilmorfolino. En una forma de realización relacionada, la molécula polimérica fisiológicamente aceptable es polietilenglicol (PEG) o un derivado del mismo.

En otro aspecto se da a conocer un anticuerpo que es capaz de unirse específicamente a una molécula polimérica fisiológicamente aceptable. En un ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.

En una forma de realización relacionada, la molécula polimérica fisiológicamente aceptable está unida a una proteína. En una forma de realización adicional, la proteína es el factor de von Willebrand (VWF) o un derivado del mismo. En otra forma de realización, la molécula polimérica fisiológicamente aceptable se elige del grupo que consiste en polialquilenglicol, polipropilenglicol, copolfmeros de etilenglicol y propilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol poliolefínico, polivinilpirrolidona, polihidroxialquilmetacrilamida, polihidroxialquilmetacrilato, polisacáridos, poll-a-hldroxiácido, alcohol polivinílico, polifosfasfaceno,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1.

Un procedimiento para la determinación del número de moléculas pollmérlcas solubles en agua unidas a una protelna o a un complejo proteico en un conjugado de pollmero-protelna, que comprende las etapas de

detectar la unión entre

(i) un conjugado de pollmero-protelna con uno o más polímeros unidos a la proteína, y

(ii) un anticuerpo que se une específicamente a dicho polímero, siendo dicho anticuerpo detectable cuando está unido a dicho conjugado de polímero-proteína,

2.

en el que el número de polímeros del conjugado de pollmero-protelna se correlaciona con los niveles de anticuerpo detectado unido al conjugado de polímero-proteína cuando se compara con un control conocido.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende un marcador detectable.

3.

El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el marcador detectable se elige del grupo que consiste en una enzima, un marcador radiactivo, un fluoróforo, un reactivo denso en electrones, biotlna, dlgoxigenlna,

haptenos y proteínas que se hacen detectables mediante la adición de cualquiera de estos marcadores.

4.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el conjugado de polímero-proteína está unido a una matriz portadora antes de su unión al anticuerpo.

5.

El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la matriz se elige del grupo que consiste en un microportador, una partícula, una membrana, una tira, un papel, una película, una microesfera o una placa.

6.

El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el nivel de anticuerpo detectado se mide como la absorbancla del marcador detectable.

7.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el conjugado de polímero-proteína se aísla usando una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y se transfiere a una membrana antes de la detección.

8.

El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el número de polímeros en el conjugado de polímero- proteína se calcula basándose en el peso molecular del conjugado de polímero-proteína en comparación con un control conocido.

9.

El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el peso molecular del complejo de polímero-proteína se correlaciona con la subunidad de proteína que comprende la molécula polimérica.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la proteína o el complejo proteico es un factor de coagulación sanguíneo o un complejo con un factor de coagulación sanguíneo.

11.

El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el factor de coagulación sanguíneo o el complejo con un factor de coagulación sanguíneo es humano.

12.

El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el factor de coagulación sanguíneo se elige del grupo que consiste en Factor II, Factor III, Factor V, Factor Vil, Factor VIII, Factor IX, Factor X, Factor XI, Factor

XII, Factor XIII, Factor de von Willebrand, protelna C y antitrombina III.

13.

El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el complejo con el factor de coagulación sanguíneo es Factor VIILVWF.

14.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el polímero soluble en agua es escindlble.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el polímero soluble en agua es hidrollzable.

16.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el polímero soluble en agua se elige del grupo que consiste en polialqullengllcol, pollpropllenglicol, copolímeros de etilenglicol y propllengllcol, poliol polioxietilado, alcohol poliolefínico, polivinilpirrolidona, polihidroxialquilmetacrilamida, polihidroxialquilmetacrilato, polisacáridos, poli-a-hidroxiácido, alcohol polivinílico, polifosfasfaceno,

polioxazolina y poli-N-acriloilmorfolino.

17.

18. 5

19.

21.

22.

23.

24.

25.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que el polímero soluble en agua es polietilenglicol (PEG) o un derivado del mismo.

El procedimiento de la reivindicación 17, en el que el PEG es desde 3 hasta 100 kDa.

El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el PEG tiene un peso molecular en un intervalo desde aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 60 kDa.

El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el PEG tiene un peso molecular en un intervalo desde aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 40 kDa.

El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el PEG tiene un peso molecular en un intervalo desde aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 15 kDa.

El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el PEG tiene un peso molecular en un intervalo desde aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 10 kDa.

Un procedimiento para la determinación del número de moléculas poliméricas solubles en agua unidas a una proteína o a un complejo proteico que comprende

poner en contacto dicho polímero con un anticuerpo que se une específicamente a dicho polímero, siendo dicho anticuerpo detectable cuando está unido a dicho polímero,

en el que el número de polímeros unidos al anticuerpo se correlaciona con los niveles de anticuerpo detectado unido cuando se compara con un control conocido.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que el anticuerpo es un anticuerpo

monoclonal.