Polipéptido de factor VII que comprende un sitio de N-glicosilación,

N-Xaa-S/T, introducido por sustituciones de aminoácidos correspondientes a aminoácidos que comienzan en la posición I69 de la SEC ID nº : 1, donde Xaa es cualquier aminoácido excepto P; en donde dicho sitio de N-glicosilación introducido reduce la afinidad de enlace de factor tisular de dicho polipéptido de factor VII.

Polipéptidos de factor VII de coagulación.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a polipéptidos del factor VII de coagulación humano nuevo, al igual que constructos de polinucleótidos que codifican tales polipéptidos, vectores y células huésped que comprenden y expresan el polinucleótido, composiciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos del factor VII, usos y métodos de tratamiento.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Coagulación sanguínea es un proceso que consiste en una interacción compleja de varios componentes de sangre (o factores) que finalmente da lugar a un coágulo de fibrina. Generalmente, los componentes sanguíneos, que participan en que han sido referidos como la "cascada" de coagulación, son proteínas enzimáticamente inactivas (proenzimas o zimógenos) que se convierten a enzimas proteolíticas por la acción de un activador (que por si mismo es un factor de coagulación activado) . Factores de coagulación que han sido sometidos tal conversión son generalmente referidos como "factores activos", y se designan por la adición de la letra "a" al nombre del factor de coagulación (p. ej. Factor VIIa) .

Iniciación del proceso hemostático se media por la formación de un complejo entre factor tisular, expuesto como resultado de herida a la pared de vaso, y factor VIIa. Este complejo luego convierte factores IX y X a sus formas activas. Factor Xa convierte cantidades limitadas de protrombina a trombina en la célula de soporte de factor de tejido. Trombina activa plaquetas y factores V y VIII en Factores Va y VIIIa, ambos cofactores en el proceso adicional conduciendo a la explosión de trombina completa. Este proceso incluye generación de Factor Xa por Factor IXa (en complejo con factor VIIIa) y ocurre en la superficie de plaquetas activadas. Trombina convierte finalmente fibrinógeno a fibrina dando como resultado formación de un coágulo de fibrina.

El factor VII es una glicoproteína de plasma de rastro que circula en la sangre como un zimógeno monocatenario. El zimógeno es catalíticamente inactivo. Factor VII monocatenario se puede convertir a Factor VIIa bicatenario por Factor Xa, Factor XIIa, Factor IXa, Factor VIIa o trombina in vitro. Factor Xa se cree que es el mayor activador fisiológico de factor VII. La conversión de factor VII de zimógeno en la molécula bicatenaria activada ocurre por escisión de un enlace peptídico interno Arg152 -Ile153.

Es frecuentemente deseable estimular la cascada de coagulación en un sujeto. Factor VIIa ha sido usado para controlar trastornos de sangrado que tienen diferentes causas tal como deficiencias factoras de coagulación (p. ej. hemofilia A y B o deficiencia de factores de coagulación XI o VII) o inhibidores de factores de coagulación. Factor VIIa también ha sido usado para controlar sangrado excesivo ocurriendo en sujetos con una cascada coagulación de sangre de funcionamiento normal (no deficiencias factoras de coagulación o inhibidores contra cualquiera de los factores de coagulación) . Tal sangrado puede, por ejemplo, ser provocado por una función de plaqueta defectuosa, trombocitopenia o enfermedad de von Willebrand. Sangrado es también un problema mayor en relación con cirugía y otras formas de daño de tejido.

La patente europea nº . 200, 421 (ZimoGenetics) se refiere al factor VII humano de codificación de secuencia de nucleótidos y la expresión recombinante de factor VII en células mamíferas.

Dickinson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 93, 14379-14384, 1996) divulga polipéptidos del factor VII donde ciertos aminoácidos han sido individualmente sustituidos por Ala. Iwanaga et al. (Tromb. Haemost. (suplemento agosto 1999) , 466 , abstracto 1474) se refiere a variantes de factor VIIa donde residuos 316-320 son eliminadas o residuos 311322 se sustituyen con los residuos correspondientes de tripsina.

Hay todavía una necesidad en la técnica para polipéptidos del factor VII mejorados con actividad procoagulante. En particular, hay una necesidad de polipéptidos del factor VII con actividad TF independiente aumentada.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a polipéptidos del factor VII con actividad TF independiente aumentada, tal como polipéptidos del factor VII de coagulación nuevo con la misma o aumentada actividad en comparación con factor VIIa de tipo salvaje y con una afinidad de enlace de factor tisular inferior a factor VIIa humano recombinante de tipo salvaje.

En un primer aspecto, la invención se refiere a un polipéptido del factor VII con una afinidad de enlace de factor tisular inferior que factor VIIa humano de tipo salvaje recombinante y sustancialmente la misma actividad o actividad aumentada en comparación con factor VIIa humano de tipo salvaje recombinante, donde dicho polipéptido del factor VII es [0011] un polipéptido del factor VII que comprende un Sitio de N-glicosilación N-Xaa-S/T introducido por sustituciones de aminoácidos correspondientes a aminoácidos iniciando en la posición de SEC ID nº : 1, donde Xaa es cualquier aminoácido excepto P, en el que dicho sitio de N-glicosilación introducido reduce la afinidad de enlace de factor tisular.

El polipéptido FVII puede ser FVII- (I69N/F71T) .

En otro aspecto, polipéptidos del factor VII de la invención son polipéptidos del factor VII, donde el constante de disociación Kd de dicho polipéptido del factor VII de factor tisular soluble (sTF) es superior a 5 nM, tal como superior a 7 nM, tal como superior a 10 nM, tal como superior a 20 nM, tal como superior a 30 nM, tal como superior a 50 nM, tal como superior a 100 nM, tal como superior a 200 nM, tal como superior a 300 nM, tal como superior a 400 nM, tal como superior a 500 nM, tal como superior a 1 μM.

En otro aspecto, polipéptidos del factor VII de la invención son polipéptidos del factor VII, donde el constante de disociación Kd de dicho polipéptido del factor VII de factor tisular (TF) es superior a 5 nM.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende un polipéptido del factor VII con una afinidad de enlace de factor tisular inferior que factor VIIa humano de tipo salvaje recombinante y sustancialmente la misma actividad o actividad aumentada en comparación con factor VIIa humano de tipo salvaje recombinante, donde dicho polipéptido del factor VII es [0016] un polipéptido del factor VII que comprende un Sitio de N-glicosilación N-Xaa-S/T introducido por sustituciones de aminoácidos correspondientes aminoácidos iniciando en la posición de SEC ID nº : 1, donde Xaa es cualquier aminoácido excepto P, en el que dicho sitio de N-glicosilación introducido reduce la afinidad de enlace factora tisular.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un polipéptido del factor VII con una afinidad de enlace de factor tisular inferior que factor VIIa humano de tipo salvaje recombinante y sustancialmente la misma actividad o actividad aumentada en comparación con factor VIIa humano de tipo salvaje recombinante, donde dicho polipéptido del factor VII es [0018] un polipéptido del factor VII que comprende un Sitio de N-glicosilación N-Xaa-S/T introducido por sustituciones de aminoácidos correspondientes a aminoácidos iniciando en la posición [0019] SEC ID nº : 1, donde Xaa es cualquier aminoácido excepto P, en el que dicho sitio de N-glicosilación introducido reduce la afinidad de enlace factora tisular; y opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención se refiere a un constructo polinucleótido que codifica un polipéptido del factor VII que comprende un Sitio de N-glicosilación N-Xaa-S/T introducido por sustituciones de aminoácidos correspondientes a aminoácidos iniciando en la posición I69 de SEC ID nº : 1, donde Xaa es cualquier aminoácido excepto P, en el que dicho sitio de N-glicosilación introducido reduce la afinidad de enlace factora tisular. El constructo polinucleótido puede ser un vector.

En otro aspecto, la invención se refiere a una célula huésped eucariota que comprende un constructo polinucleótido que codifica un polipéptido del factor VII que comprende un Sitio de N-glicosilación N-Xaa-S/T introducido por sustituciones de aminoácidos correspondientes a aminoácidos iniciando en la posición I69 de SEC ID nº : 1, donde Xaa es cualquier aminoácido excepto P, en el que dicho sitio de N-glicosilación introducido reduce la afinidad de enlace factora tisular. La célula huésped eucariota puede... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido de factor VII que comprende un sitio de N-glicosilación, N-Xaa-S/T, introducido por sustituciones de aminoácidos correspondientes a aminoácidos que comienzan en la posición I69 de la SEC ID nº : 1, donde Xaa es cualquier aminoácido excepto P; en donde dicho sitio de N-glicosilación introducido reduce la afinidad de enlace de factor tisular de dicho polipéptido de factor VII.

2. Polipéptido de factor VII según la reivindicación 1, que es FVII- (I69N/F71T) .

3. Polipéptido de factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la constante de disociación Kd de dicho polipéptido del factor VII para factor tisular soluble (STF) es superior a 5 nM, tal como superior a 7 nM, tal como superior a 10 nM, tal como superior a 20 nM, tal como superior a 30 nM, tal como superior a 50 nM, tal como superior a 100 nM,

tal como superior a 200 nM, tal como superior a 300 nM, tal como superior a 400 nM, tal como superior a 500 nM, tal como superior a 1 μM.

4. Polipéptido de factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la constante de disociación KD de dicho factor VII para factor tisular (TF) es superior a 5 nM.

5. Composición que comprende un polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Constructo polinucleótido que codifica un polipéptido de factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

7. Constructo polinucleótido según la reivindicación 6, que es un vector.

8. Célula huésped eucariota que comprende el constructo polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 6-7.

9. Célula huésped eucariota según la reivindicación 8, que es de origen mamífero.

10. Célula huésped eucariota según la reivindicación 9, donde dicha célula es seleccionada del grupo que consiste en células CHO, células BHK o células HEK.

11. Método para la producción del polipéptido de factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, comprendiendo el método el cultivo de una célula huésped eucariota según cualquiera de las reivindicaciones 8-10 en un medio de crecimiento apropiado bajo condiciones que permiten la síntesis de proteínas a partir de dicho constructo polinucleótido y la recuperación de dicho polipéptido de factor VII a partir del medio de cultivo.