Nuevos péptidos antivirales que impiden la unión del virus a DLC8.

Un elevado número de agentes patógenos de origen viral se sirven de la maquinaria de transporte intracelular basada en la dineína en algún momento de su ciclo infectivo. La presente invención consiste en una nueva terapéutica antiviral consistente en bloquear las infecciones víricas producidas por aquellos virus que utilizan el sistema de la dineína (DLC8) mediante mecanismos de interferencia con el uso que los virus hacen de dicha proteína celular, bien mediante antagonistas de la función de la dineína o por bloqueo de la interacción entre la proteína vírica y la proteína celular

Nuevos péptidos antivirales que impiden la unión del virus a DLC8.

Campo de la invención

Los virus son parásitos intracelulares que requieren de la integridad de ciertas funciones celulares para que su ciclo replicativo dentro de las células pueda realizarse con éxito. La dineína ha demostrado tener un papel relevante en distintos pasos de la infección de virus tan distintos como el virus de la rabia, el virus Herpes simple humano tipo I o el virus de la inmunodeficiencia humana. La dineína es una proteína motora microtubular, que interviene en la internalización y el transporte intracelular ligado a microtúbulos y es moduladora de varias vías de traducción de señales intracelulares, entre otras funciones. Los virus utilizan la dineína para su internalización y transporte intracelular, para la formación de la factoría vírica donde se van a producir los nuevos viriones y para la regulación de las señales intracelulares necesarias en la coordinación de estos y otros procesos. Hemos demostrado, con uno de estos modelos virales, que el interferir este sistema supone el bloqueo de la infección lo que proporciona la prueba de principio para una nueva estrategia antiviral que constituye el objeto de la presente invención.

Antecedentes de la invención

La base de este nuevo procedimiento terapéutico se ha desarrollado a través del estudio de las interacciones de tipo proteína de origen viral - proteína de origen celular, que son una fuente de conocimiento de nuevas dianas terapéuticas. Hemos identificado los dominios de interacción de algunas de las proteínas implicadas y esta información ha sido utilizada para el diseño de péptidos que son la prueba de principio de antagonistas del par de proteínas que interaccionan o, al menos, de una de las dos.

En concreto, hemos encontrado que la proteína del virus de la Peste porcina africana (VPPA) p54, que está externamente expuesta en la partícula vírica interacciona con una proteína celular que forma parte del complejo motor microtubular basado en la dineína y cuya función está relacionada esencialmente con el transporte intracelular.

Está interacción se encontró empleando el sistema de doble híbrido en levaduras, para buscar en una genoteca de macrófago porcino posibles proteínas de interacción de la proteína vírica p54 [1]. La secuencia codificante para p54 (gen E183L) se encuentra incluida en la secuencia completa del aislado BA71V, depositada en la base de datos del NCBI con número de acceso U18466. Los clones obtenidos e identificados como positivos se secuenciaron para descubrir que contenían la secuencia codificante completa de la cadena ligera de la dineína de 8 kilodaltons (kDa), llamada DLC8, LC8, DLC1, DNLC1 o PIN (proteína inhibidora de la sintetasa del oxido nítrico neuronal). La secuencia codificante para dicha cadena en Sus scrofa se encuentra depositada en la base de datos del NCBI con el número AF436777. Posteriormente este resultado fue corroborado utilizando otro tipo de técnicas entre las que figuran la cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación y colocalización de ambos componentes en los mismos compartimentos celulares mediante microscopía confocal. Los resultados obtenidos confirmaron la interacción entre p54 y DLC8, demostrando además la especificidad de ésta [1].

DLC8 es una proteína con una secuencia aminoacídica altamente conservada entre especies evolutivamente muy distantes (desde nematodos al hombre), lo que ya sugiere la relevancia de la función de esta proteína en las células [2, 3]. Las dineínas citoplásmicas son una familia de motores moleculares que conducen a lo largo de los microtúbulos cargas muy diferentes. Se encargan del transporte de vesículas y organelas desde el exterior de la célula al interior, a la zona nuclear o perinuclear (tráfico hacia el polo negativo de los microtúbulos). Son grandes complejos multiproteicos, constituidos por de una a tres cadenas pesadas con una cabeza globular y actividad ATPasa que son las responsables de generar la energía necesaria para producir movimiento. Unidas a estas cadenas pesadas se encuentra un número variable de cadenas intermedias y de cadenas ligeras. Estas últimas son las responsables de interaccionar directamente con la carga a transportar. Se han descrito, hasta la fecha, siete familias de cadenas ligeras, entre las que podemos encontrar a DLC8. DLC8 se encuentra dispuesta como un dímero in vivo, lo que permite la existencia de dos lugares idénticos de unión a diferentes péptidos entre ambos monómeros.

Con respecto a la proteína celular, DLC8 presenta dos tipos de lugares preferencias de unión con las proteínas celulares con las que interacciona. Uno de los motivos 1) (Lys/Arg)XThrThr (siendo X un amino ácido cualquiera) es el que se encuentra uniendo DLC8 con la cadena intermedia de la dineína, con la molécula proapoptótica Bim, los factores de transcripción Kid1 y Swallow y algunas proteínas virales de diverso origen. Este sitio de unión está localizado en un cañón hidrofóbico entre los dos dímeros de la molécula de DLC8. El segundo motivo es: Gly(Ile/val)GlnValAsp es el que une DLC8 con la oxido nítrico sintetasa neuronal (nNOS) o con la proteína de skafolding neuronal.

Diversos virus utilizan la cadena ligera de la dineína en distintas etapas de su ciclo infectivo en el interior de la célula huésped, por lo que las estrategias antivirales objeto de la presente invención tratan de bloquear la infección de dichos virus por interferencia con el uso que los virus hacen de la dineína celular, es decir bloqueando bien su función o bien los sitios de unión que permiten a las distintas proteínas de origen vírico el utilizar la dineína. La presente invención pone de manifiesto por primera vez que el bloqueo de la función de esta molécula mediante péptidos cuya secuencia comprende o consiste en, la totalidad o una secuencia parcial correspondiente al dominio de unión con DLC8. La invención se ejemplifica mediante péptidos obtenidos de la secuencia de p54 del VPPA y que impiden que la infección se complete, siendo la base para una terapéutica antiviral.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Esquema de infección viral de células e inhibición de dicha infección por acción de los péptidos de la invención. 1.- Células Vero cultivadas a una densidad de 9x10⁴/cm² la noche anterior en DMEM 5%. 2.- Se añaden 300 µl de soluciones con diferentes péptidos en el rango 0 a 100 µM en DMEM SC durante 1 h a 37ºC para internalización de los péptidos. 3.- Infección con 1 µf/cel. de BA71V. 4.- Adsorción de 2 h a 37ºC. 5.- Eliminación del virus residual con 2 lavados con 11 ml de DMEM SC. 6.- Transcurso de la infección desde 6 a 18 h post-infección en DMEM + péptidos. 7.- Detección de células infectadas; Observación del efecto citopático del cultivo celular; Análisis de proteínas virales tempranas 8p30) y tardías (p72) por Western Blot.

Figura 2: Visualización de la internalización del péptido antiviral COVA2 marcado con fluoresceína, a diferentes concentraciones (5, 25, 50 y 100 µM), en células Vero, mediante microscopía de fluorescencia.

Figura 3: Visualización por microscopía convencional de la inhibición del efecto citopático de VPPA en presencia de concentraciones crecientes de péptidos antivirales (RS27 y PS19) en las columnas 1 y 2, controles (RS28 y SS20) en las columnas 3 y 4 y en ausencia de péptidos en la columna 5.

Figura 4: Histograma de porcentajes de reducción de células Vero infectadas con VPPA (ordenadas), preincubadas con concentraciones crecientes (5, 25, 50 y 100 µM) de péptido antiviral COVA2 o péptido control RS28 (abcisas).

Figura 5: Histograma de reducción de síntesis de proteínas virales de VPPA medido por Western Blot (ordenadas), en presencia de concentraciones crecientes (25, 50 y 100 µM) de péptido antiviral COVA1 (abcisas). Gris: proteína temprana p30; Negro: proteína tardía p72.

Descripción de la invención

Recientes trabajos, llevados a cabo por nuestro grupo de investigación empleando técnicas de resonancia magnética nuclear (RMN) con ambas proteínas (p54 y DLC8) producidas en sistemas heterólogos, han proporcionado datos que han permitido conocer en detalle dicha interacción. Se han identificado aquellos residuos de DLC8 que se modifican en el espectro HSQC característico de la DLC8, y que por lo tanto están involucrados en la interacción con p54. Estos residuos serían los siguientes: Trp54, Lys9, Ser88, Asn6l, Asn23, Asn33, Gly59, Ser86, Arg60, Glu15, y Tyr75.

La presente invención...

1. Composición antiviral que comprende un péptido capaz de inhibir la unión de los virus o una proteína de los mismos a la proteína DLC8 caracterizada porque el péptido comprende una secuencia seleccionada entre: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, o cualquier secuencia análoga a alguna de las anteriores con cambios conservativos en al menos un amino ácido.

2. Composición antiviral, según la reivindicación 1, que además comprende cualquier vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

3. Composición antiviral según la reivindicación 1 ó 2 útil en el tratamiento de las infecciones atribuibles a un virus seleccionado entre: VPPA, virus del papiloma humano, adenovirus, entomopoxvirus A. moorei, virus vaccinia, virus respiratorio sincitial, virus coxackie humano, virus de la rabia, virus del Herpes simple humano, virus Mokola o el virus del SIDA.

4. Composición antiviral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizada porque el péptido comprende la secuencia SEQ ID NO: 18 o comprende una secuencia análoga a la anterior con cambios conservativos en al menos un amino ácido y la infección viral a tratar es causada por VPPA.

5. Composición antiviral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizada porque el péptido contiene además una cola de Argininas en su extremo N-terminal para incrementar su internalización en la célula.

6. Composición antiviral según la reivindicación 5 en que la cola consta de 8 Argininas.

7. Composición antiviral según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada por consistir en un péptido seleccionado entre: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 1.

8. Método de selección de compuestos antivirales y de evaluación de su eficacia caracterizado por:

9. Método de selección de compuestos antivirales y de evaluación de su eficacia caracterizado por: