Método de identificación de inhibidores de paraqueratosis epidérmica.

Procedimiento in vitro para la identificación de sustancias que inhiben la paraqueratosis epidérmica, en donde se utiliza de indicador la actividad de una sustancia candidata que inhibe la actividad cisteína proteasa inhibidora que posee el antígeno 1 del carcinoma epidermoide

(SCCA-1, por su nombre en inglés), en donde la cisteína proteasa es la caspasa 14.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E11173296.

Solicitante: SHISEIDO COMPANY, LTD..

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 5-5 Ginza 7-chome Chuo-ku Tokyo 104-8010 JAPON.

Inventor/es: KATAGIRI,Chika, NAKANISHI,Jotaro, HIBINO,Toshihiko.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/50 (Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q))

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Método de identificación de inhibidores de paraqueratosis epidérmica.

Fragmento de la descripción:

Método de identificación de inhibidores de paraqueratosis epidérmica Campo de la técnica

La presente invención da a conocer un procedimiento para la identificación de sustancias que inhiben la paraqueratosis epidérmica basándose en la actividad de sustancias candidatas que inhiben la actividad cisterna proteasa que posee el antígeno 1 del carcinoma epidermoide (SCCA-1).

Antecedentes de la técnica

El SSCA es un antígeno que se extrae de las células del epitelio pavimentoso que se encuentra en alta concentración en la sangre obtenida de los pacientes que padecen el carcinoma epidermoide del cuello uterino, de los pulmones, del esófago y de la piel, y se utiliza con frecuencia para diagnosticar el carcinoma epidermoide (H. Kato et al., Cáncer, 40: 1621-1628 (1977); N. Mino et al., Cáncer, 62. 730-734 (1988)). Ya que la concentración de SCCA en la sangre muestra una correlación favorable con factores tales como la progresión del estadio del carcinoma epidermoide, el grado de neoplasia maligna y el tamaño del tumor en concreto, es un marcador particularmente eficaz no sólo para la detección precoz del cáncer, sino también para la evaluación de los efectos del tratamiento contra el cáncer y el diagnóstico del riesgo de recidiva.

Además, también se sabe que se incrementa la expresión de SCCA en la capa superior de la epidermis psoriásica (Takeda et al., J. Invest. Dermatol. (2002) 118(1), 147-154). La psoriasis es un tipo de enfermedad de la piel en forma de paraqueratosis inflamatoria crónica y recurrente que se caracteriza por la proliferación y la diferenciación anormales de las células epidérmicas, y la infiltración de células inflamatorias. Se cree que la psoriasis se produce debido a factores genéticos además de diferentes factores medioambientales (Hopso-Havu et al., British Journal of Dermatology (1983) 109, 77-85).

El SCCA está codificado por dos genes, SCCA-1 y SCCA-2, dispuestos en tándem en el cromosoma 18q21.3. Las proteínas SCCA-1 y SCCA-2 codificadas por estos genes tienen una masa molecular de unos 45.000 Da y, aunque son muy homologas entre sí, se cree que tienen funciones diferentes debido a que difieren en la secuencia de aminoácidos del sitio de reacción (Schick et al., J. Biol. Chem. (1997) 27231, 1849-55). Aunque se sabe que SCCA- 1 y SCCA-2 se expresan mucho en enfermedades tales como el carcinoma epidermoide y la psoriasis, está poco claro qué funciones desempeñan en las células enfermas.

Por otra parte, se sabe que los queratinocitos tienen la función de formar una barrera protectora denominada la «capa queratinizada» contra entornos perjudiciales como resultado de la diferenciación terminal. El proceso de la diferenciación terminal está controlado de forma exacta por un programa de diferenciación y comienza con las células básales proliferativas, va a través de las etapas de células espinosas, células granulares y, finalmente, termina con la diferenciación en queratinocitos. Se producen cambios considerables dentro y fuera de los queratinocitos durante el periodo de transición de células granulares a queratinocitos. Los queratinocitos pierden el núcleo y los orgánulos celulares, mientras que adquieren una capa de lípidos periférica, una membrana celular reforzada que se denomina tegumento córneo y un patrón de queratina. El patrón de queratina mantiene una estructura interna flexible y hermética. De acuerdo con resultados anteriores, los queratinocitos que están en diferenciación muestran características apoptósicas tales como células con fragmentación del ADN y células positivas con TUNEL (Haake A. R., J. Invest. Dermatol. 101, 107-12 (1993)). Se ha detectado actividad de tipo caspasa en los extractos de queratinocitos humanos, y se expresan diferentes tipos de caspasas en los queratinocitos humanos. Sin embargo, otros resultados han indicado que las caspasas proapoptósicas típicas tales como caspasa 3, caspasa 6 y caspasa 7 no están activadas en el momento de la diferenciación terminal. Las anomalías de la diferenciación conducen con frecuencia a la presencia permanente de núcleos en la capa queratinizada, lo que se denomina «paraqueratosis». La paraqueratosis ocasiona un daño grave a la función de barrera que tiene la piel. Sin embargo, aún está por determinar qué factores intervienen en el procedimiento de desnucleación y la manera en la que este proceso está regulado durante la diferenciación de los queratinocitos.

Wrench y Didierjean («Antibodies to orthokeratotic keratinocytes in monitoring the drug induced inhibition of parakeratotic differentiation in adult and infant mice» ARCHIVES OF DERMATOLOGICAL RESEARCH, vol. 227. n.° 3, 1 de febrero de 1985, páginas 201-208) estudiaron dos modelos experimentales de inhibición inducida por fármacos para la paraqueratosis (PQ): (1) la supresión del desarrollo normal de la PQ en la cola del ratón lactante y

(2) la conversión de la PQ en ortoqueratosis. Encontraron que los fenoles del alquitrán de alta ebullición ocasionan una inhibición más potente de la PQ que el valerato de betametasona.

En la patente europea EP1550459 A1 se describen inhibidores de la paraqueratosis ocasionada por los componentes estimulantes que hay en el sebo en torno a los poros prominentes. Estos agentes comprenden un antagonista de un receptor de las células excitatorias, por ejemplo, un receptor de glutamato tal como el receptor del ácido A/-metil-D-aspártico o un receptor de ATP tal como el receptor P2X, o un agonista de un receptor inhibidor de la célula tal como el receptor del y-aminobutirato tal como el receptor sensible a la bicuculina que tiene un canal de Cl, o un receptor de glicina.

Las caspasas son factores de ejecución de la muerte celular apoptósica que se conocen bien y son cistelna proteasas conservadas en el proceso evolutivo que escinden los sustratos tras un resto de ácido aspártico. Las caspasas de los mamíferos se dividen en tres subgrupos de acuerdo con su estructura y función, a saber, caspasas iniciadoras, caspasas efectoras y caspasas Inflamatorias. Las caspasas efectoras cumplen la importante función de degradar el ICAD, el Inhibidor de la CAD (ADNasa activada por caspasa), lo que da lugar a que la CAD se disocie como una nucleasa activa (Enari M. et al., Nature, 391, 43-50 (1998)). La actividad de las caspasas está regulada por distintas moléculas. En particular, hay tres grupos de proteínas inhibidoras en colaboración directa con varias caspasas. La protelna antlapoptóslca p35 de baculovlrus inhibe las caspasas 1, 3, 6, 7, 8 y 10 sin actuar sobre las serina proteinasas ni sobre otras cisterna protelnasas (Zhou Q. et al., Biochemistry, 37, 10757-65 (1998)). El baculovirus también sintetiza otras proteínas antlapoptóslcas e inhibidores de las proteínas apoptóslcas (IRA). En los mamíferos también se encuentran homólogos de los IPA (Verhagen A. M. et al., Genome Biol., 2, Reviews 3009 (2001)). El IPA de los mamíferos bloquea la apoptosls mediante la inhibición de la caspasa 14 o al antagonizar con los factores proapoptóslcos, tales como DIABLO/Smac (Wu G., Nature, 408, 1008-12 (2000)). El modificador A de la respuesta de atocinas (Crm A) es un producto genético del virus de la viruela vacuna que es capaz de inhibir las caspasas apoptósicas y las caspasas inflamatorias (García-Calvo M. et al., J. Biol. Chem., 273, 32608-13 (1998)). Es muy interesante que el Crm A se haya sugerido que pertenezca a una superfamilia de inhibidores de serina proteinasas, y que algunos inhibidores de serina proteinasas, tales como PI-9 y PAI-1, sean capaces de inhibir la apoptosis al interaccionar con la caspasa 1 y la caspasa 3, respectivamente (Annand R. R. et al., Biochem. J., 342Pt3, 655-65 (1999)). Por lo tanto, será interesante determinar si la diferenciación terminal de los queratinocitos... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento in vitro para la identificación de sustancias que inhiben la paraqueratosis epidérmica, en donde se utiliza de indicador la actividad de una sustancia candidata que inhibe la actividad cisterna proteasa inhibidora que posee el antigeno 1 del carcinoma epidermoide (SCCA-1, por su nombre en inglés), en donde la cisterna 5 proteasa es la caspasa 14.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende los siguientes sistemas de ensayo (1), (2) y

(3):

(1) medir la actividad cisterna proteasa y obtener el valor medido [x];

(2) i) mezclar un compuesto candidato con una cantidad igual de cisterna proteasa definida en el punto (1)

anterior en términos de actividad enzimática seguido de incubación; y

ii) medir la actividad cisterna proteasa de la mezcla incubada del punto (2) i) anterior en las mismas

condiciones que el punto (1) anterior y obtener el valor medido [y]; y,

(3) i) mezclar el compuesto candidato en una cantidad igual a la utilizada en el punto (2) i) con SCCA-1 seguido de la incubación;

ii) mezclar la mezcla incubada del punto (3) i) con una cantidad igual de cisterna proteasa definida en el punto (1) anterior en términos de actividad enzimática, e incubar en las mismas condiciones que en el punto (2) i) anterior; y

iii) medir la actividad cisterna proteasa de la mezcla incubada del punto (3) ii) anterior en las mismas condiciones que el punto (1) anterior y obtener el valor medido [z]; en donde,

el compuesto candidato se determina que tiene actividad que inhibe la actividad cisterna proteasa inhibidora que posee SCCA-1 y se selecciona como una sustancia que inhibe la paraqueratosis epidérmica si satisface la condición siguiente:

{[z]/[x] x 100} - {100 - [y]/[x] x 100} > 0.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la condición a satisfacer es 25 {[z]/[x] x 100} - {100 - [y]/[x] x 100} > 3.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la condición a satisfacer es {[z]/[x] x 100} - {100 - [y]/[x] x 100} > 16.