METODO DE DIAGNOSTICO IN VITRO DE PACIENTES CON LINFOMA ESPLENICO DE LA ZONA MARGINAL.

Método de diagnóstico in vitro de pacientes con linfoma esplénico de la zona marginal.

La presente invención describe un método de diagnóstico in vitro de LEZM basado en el análisis de la expresión de una serie de genes localizados en una región muy específica delecionada del cromosoma 7 humano. La región específica delecionada en pacientes con LEZM ha sido definida mediante la utilización CGH arrays de alta afinidad y se localiza en 7q22.1 entre las bases 99925039-101348479, donde se encuentran los genes: TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, SH2B2, MUC17 y CUX1. Además en la presente invención se describen kits de diagnóstico in vitro de LEZM, que comprenden al menos una sonda que reconozcan la región delecionada en 7q22.1 o que hibride con al menos una de las secuencias nucleotídicas de los genes mencionados anteriormente.

Método de diagnóstico in vitro de pacientes con linfoma esplénico de la zona marginal.

Campo de la invención

La presente invención se encuadra en el ámbito de la biomedicina y en el campo farmacéutico, más específicamente, se refiere a un método de diagnosis in vitro, para el diagnóstico de pacientes que padecen la enfermedad neoplásica: linfoma esplénico de la zona marginal (LEZM) . Además la presente invención también hace referencia a un kit de diagnóstico in vitro de pacientes con LEZM.

Antecedentes

El Linfoma Esplénicodela Zona Marginal (LEZM) , es una enfermedad tumoral que puede afectara cualquier órgano, aunque los más comunes sonel bazoylosganglios linfáticos.Ha sido consideradocomo una entidad clínico-patológica distinta desde hace años (Schmid C et al. Am J Surg Pathol 1992, 16: 455-466) . Más recientemente, la clasificaciónde enfermedadeshematológicas de la Organización Mundialdela Salud (OMS) , ha designadoalos LEZM como un subtipo distinto de linfomas no-Hodgkin (Harris NL, et al. Histopathology 2000, 36: 69-86) (LNH) , en basea su morfología, inmunofenotipoy características clínicas, junto con los linfomas asociadosa mucosas (MALT) ylos linfomas de la zona marginal nodal (LZMN) . Estos tres subtipos de LNH: LEZM, linfomas MALTyLZMN, están incluidosenlos linfomas de la zona marginal porque tienensu origen comúnenel compartimentomarginalde las célulasBde los nódulos linfáticosy del bazo.

En el diagnóstico de los linfomas, es importante clasificar cada uno dentro del subtipo al que pertenece para poder dar al paciente el tratamiento adecuado, ya que cada tipo de linfoma tiene un tratamiento distinto. Así, por ejemplo, en el caso del LEZM no se debe aplicar quimioterapia en primera instancia, siendo el tratamiento más adecuado la extirpación del órgano afectado, generalmente el bazo, por lo que es muy importante diagnosticarlo correctamente. El diagnóstico de los LNHy la diferenciación entre cada uno de ellos se basa en las características morfológicas, inmunohistoquímicasymoleculares, siendo las alteraciones genéticas en general, ylas traslocaciones específicas en particular, unade las características que más está ayudando para distinguir unos linfomasde otros.La mayoríadelos LNH se caracterizan por la presencia de traslocaciones específicas, que sirven para su diagnóstico. Sin embargo, los LEZM carecendeun marcador molecular conocido pues, a diferenciade otros linfomas, noseha identificadoenellos una traslocación que les sea característica, lo que dificulta su diagnóstico. Si bien los análisis citogenéticos muestran queen estetipode tumores puedendetectarse pérdidasenlasqueestáninvolucradoslos cromosomas 1, 3, 7y 8 (Dierlamm J, et al., Blood 1996, 87: 299-307; SoléF, et al., BrJHaematol1997; 98: 446-449) , existen pocos estudios que demuestrenlaexistenciade una alteración que fuera específicay característicade los LEZMy que permitiera la identificación de una alta proporción de aquellos pacientes que la padecen. Estudios de citogenética convencional pusieron de manifiesto que una de las alteraciones más frecuentes en los LEZM eran las pérdidas en el brazo largo del cromosoma7 (del (7q) ) , loquepodíasugerirqueladel (7q) está asociadaconlosLEZM (Br y nesRK, et al., ModPathol 1996, 9: 995-1000; Hernández JM, et al., Leukemia 1995, 9: 2140-2146) . En esos primeros estudios se estimaba que las deleciones en el brazo largo del cromosoma 7 no se presentaban en más de un 25% de los pacientes aquejados de LEZM (FrancoV, et al., Blood 2003; 101:2464-2472) , por lo que no se consideraba que el desarrollo de métodos diagnósticos basados en su detección pudiera tener interés, al permitir identificar sólo una proporción muy bajadel total de pacientes aquejados de LEZM. Posteriormente, estudios de pérdida de heterocigosidad demostraron que la presencia de una pérdida alélica en los LEZM (40%) es mayor que la observada en otros síndromes linfoproliferativos de células-B.

La técnica utilizada más habitualmente para realizar los estudios de los cambios producidos en los cromosomas asociados con los LEZM ha sido la hibridación genómica comparada (CGH) , metodología que permite la determinacióndegananciasypérdidasenelnúmerodecopiasentredos muestrasdeADN, medianteuna hibridacióncompetitiva de ADN normaly del ADN tumoral en estudio (cada unode ellos marcados con un fluorocromo diferente) sobremetafases de individuos normales, evaluando después si existen zonas en las que se produzca un aumento de la señal correspondienteal fluorocromoconelquesehaya marcadoelADN tumoral (loqueseconsideraindicativodeganancias) o disminuciones de dicha señal, aumentando la señal correspondiente al otro fluorocromo, eldel ADN normal (lo que se considera indicativo de pérdidas) . Estudios de CGH confirmaron que hay distintas regiones del genoma implicadasen estos linfomas, tales como5q, 7q, 9q, 12qy20q, encontrando, además, queexiste una correlaciónentre las pérdidasde material genómicoyel acortamiento del períodode supervivencia (Hernández J.M., et al AmJPathol. 2001 May; 158:1843-50) .

Mediante la utilización de dichas técnicas se ha observado que la región 7q31-q36 en particular, parece estar estrechamente relacionada con los LEZMy en ella se encuentrana menudo deleciones en los pacientes aquejadosde esta enfermedad. Dicha región comprende una zona muy amplia del genoma, en la que no se han encontrado genes candidatos que sirviesen para el diagnóstico de la enfermedad (Algara P, et al., Blood 2002, 99:1299-1304; Ocio EM, et al., ClinicalLymphoma 2005, 4: 241-245) .Apesar de haber sido de gran utilidad en el conocimiento de las alteraciones genómicas en los procesos tumoralesyen especial en los linfomas, (para cuyo conocimiento, clasificación ypronóstico ha sido de gran utilidad) , la técnica de la CGH tiene una capacidad de resolución limitada: por una parte, los cambios que impliquen delecionesde segmentos inferiores a7Mb no son detectables (BentzM, et al., Genes Chromosomes Cancer 1998; 21:172-175) y por otra parte, la determinación de los puntos exactos del cromosoma entre los cuales se inserta la amplificación o que suponen los límites de la deleción es difícil, ya que la región mínima delecionada es demasiado extensa como para poder ser analizada con una sonda de hibridación in situ (Hernández J.M., et al., AmJPathol. 2001 May; 158:1843-50) .

Laspérdidasdelbrazolargodel cromosoma7, comoyaseha comentado, sonunadelas alteracionesquemássehan detectadohastaahoraenlos estudiosrealizadossobreLEZM, yasea mediantelas técnicasdeCGHomediante técnicas de hibridación fluorescente in situ (FISH) . Sin embargo, las amplias regiones delecionadas encontradas mediante dichas técnicas, han mostrado problemas a la hora de definirlas, ya que las sondas utilizadas eran de gran tamaño, no mostrando la suficiente seguridad ni especificidad para su uso en el diagnóstico de la enfermedad.

En la patente española ES2284408 solucionan dicho problema mediante el uso de arrays genómicos, también llamadosCGH-arraysoarraysdeCGH.LosCGH-arrayssonunmétodopara identificar alteracionesenelgenoma, sin ser capaz de detectar translocaciones recíprocas. Se trata de una técnica que combina la tecnología de los micro-arrays con la tecnología de laCGH, en la que la hibridación se realiza reemplazando las metafases de los cromosomaspor segmentos de ADN mapeados, cuyo conjunto representa todos los cromosomas o brazos de cromosomas, divididos en fragmentos clonados en cromosomas artificiales de levadura (YAC) , cromosomas artificiales de bacteria (BAC) , cromosomas artificiales basados en el genoma del bacteriófago P1 (PAC) , cósmidos u otros vectores de clonación. De esta manera, aumenta el nivel de resolución, que deja de ser cromosómico (distancias medidas en megabases) pasandoapodersermedidoen kilobases.Lasventajasdeesta metodologíasonlamayor resoluciónylaposibilidadde realizarunmapeodirectodelclonoclonesquese encuentraninvolucradosenelcambiogenómico.Lapatenteespañola ES2284408divulgaelusodeunBAC/PAC-array específicode3500clonesconuna resoluciónde1Mb.Los resultados mostrados en dicha patente, ponen de manifiesto que los pacientes con LEZM presentan una deleción en la región 7q22.1-q22.2, definidapor la sonda portadoradela secuencia correspondienteal fragmentodel cromosoma7humano contenidoenelBAC/PAC-array, denominada RP11-44M6.En dichapatentesedivulga también, el uso opcional, en el mismo ensayo, de otras sondas diferentes que reconocen otra región delecionada también enel cromosoma 7, la región 7q32-q33, aumentando así el porcentaje de pacientes con LEZM que pueden ser diagnosticados en la misma prueba.

En... [Seguir leyendo]

1. Método de diagnóstico in vitro de LEZM que comprende un paso de detección de la deleción comprendida entre las bases 99925039-101348479 localizadas en la región 7q22.1, en la que se localiza al menos el gen CUX1, mediante la utilización de arrays genómicos de alta afinidad.

2. Método según la reivindicación1 caracterizado porque además en dicha región se localizan entre otros, los genes TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, SH2B2 yMUC17.

3. Métodosegúnla reivindicación1 o2 que comprende ademásla deteccióndela deleción comprendida entre las bases 102949624-145959694 en la región 7q22.2-q35 en la que se localizan, entre otros, los genes: RELN, LHFPL3, PBEF1, THAP5, IMMP2L, FOXP2, TES, MET, ST7, PTPRZ1, GRM8, UBE2H, MLKN1, BPGM, CALD1, PTN, SVOPL, AGK, KEL, TPK1 yCNTNAP2 mediantela utilizaciónde arrays genómicosde alta afinidad.

4. Métodosegún cualquieradelasreivindicaciones1, 2º3 caracterizado porque se realiza sobre una muestra de ADN seleccionadade:una muestra procedentedeuntejido infiltradocon célulasde linfoma, deunaspiradodemédula ósea o de una muestra de sangre total.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque los arrays genómicos de alta afinidad utilizados se seleccionan entre:BAC/PACCGH-array, CGH-array Agilent, CGH-array NimbleGenyTilingarray de NimbleGen específico del cromosoma 7.

6. Método de diagnóstico in vitro de LEZM que mide el nivel de expresión de al menos el gen CUX1, localizado en la deleción de la región 7q22.1 comprendida entre las bases 99925039-101348479.

7.Métodosegúnlareivindicación6que comprendeademásla medicióndelniveldeexpresióndeal menos unode los genes seleccionados del grupo TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, SH2B2, MUC17 y/o cualquiera de sus combinaciones, localizados en la deleción de la región 7q22.1 comprendida entre las bases 99925039-101348479.

8. Método según las reivindicaciones6 o7 caracterizado porque se realiza sobre una muestra de ARN seleccionada de: una muestra procedente de un tejido infiltrado con células de linfoma, de un aspirado de médula ósea o de una muestra de sangre total.

9. Método de diagnóstico in vitro de LEZM que comprende una combinación en cualquier orden, de un paso de detección de la deleción comprendida entre las bases 99925039-101348479 localizada en la región 7q22, 1, mediante la utilizaciónde arrays genómicosdealta afinidadyotropasoquemideelniveldeexpresióndeal menoselgenCUX

1.

10. Métodosegúnlareivindicación9 caracterizado porque además comprendela medicióndelniveldeexpresión de al menos uno de los genes seleccionados entre: TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, SH2B2 yMUC17 y/o cualquiera de sus combinaciones.

11. Método según las reivindicaciones9 o10 que además comprendela deteccióndela deleción comprendida entre las bases 102949624-145959694 en la región 7q22.2-q35 donde se localizan, entre otros, los genes: RELN, LHFPL3, PBEF1, THAP5, IMMP2L, FOXP2, TES, MET, ST7, PTPRZ1, GRM8, UBE2H, MLKN1, BPGM, CALD1, PTN, SVOPL, AGK, KEL, TPK1 yCNTNAP2, mediante la utilización de arrays genómicos de alta afinidad.

12. Kit de diagnóstico in vitro de LEZM que comprende un conjunto de sondas seleccionadas entre las comprendidasenel grupoSEQID NO:1, SEQID NO:2ySEQID NO:3, que hibriden totalo parcialmente sobrela deleción comprendida entre las bases 99925039-101348479 localizadas en la región 7q22.1, mediante arrays genómicos de alta afinidad.

13. Kit según la reivindicación 12 que además comprende al menos una sonda que hibride total o parcialmente sobre la deleción comprendida entre las bases 102949624-145959694 en la región 7q22.2-q35, mediante arrays genómicos de alta afinidad, siendo preferentemente dicha sonda la definida como SEQ ID NO:4.

14. Kit según la reivindicación 13 caracterizado porque la sonda hibrida en la región 7q33.

15. Kit de diagnóstico in vitro de LEZM que detecta la expresión de al menos el gen CUX-1, localizado en la deleción de la región 7q22.1 comprendida entre las bases 99925039-101348479, localizadas en la región 7q22.1, medianteRT-PCR utilizandolos cebadores definidos comoSEQIDNO:5ySEQIDNO:6.

16. Kit según la reivindicación 15 caracterizado porqueademás detectalaexpresióndeal menosunodelosgenes seleccionados entre TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, SH2B2 yMUC17 y/o cualquiera de sus combinaciones mediante cebadores específicos para las secuencias de dichos genes.