Un método de producción de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos,

caracterizándose el método por determinar el perfil de una secuencia de aminoácidos introducida para identificar una parte de dicha secuencia de aminoácidos que se predice promueve la agregación de un polipéptido definido por dicha secuencia, comprendiendo el método:

determinar una propensión a la agregación para cada aminoácido de dicha secuencia introducida a fin de determinar un perfil de propensión a la agregación para dicha secuencia introducida; y

comparar dichas propensiones a la agregación de dicho perfil de propensión a la agregación a fin de determinar una o más partes de dicha secuencia introducida que se predice promueven la agregación; utilizar dichas una o más partes de dicha secuencia introducida que se predice promueven la agregación para diseñar un polipéptido modificado que es más o menos propenso a agregarse o que tiene una propensión a agregarse dentro de un intervalo deseado; y

producir luego un polipéptido de acuerdo con el diseño; y

en donde dicha determinación comprende determinar, para cada aminoácido de dicha secuencia, un valor de hidrofobicidad, y un valor de propensión a hélice α y/o lámina ß, un valor de carga, y un valor patrón que representa un patrón de aminoácidos hidrófilos y/o hidrófobos en la proximidad de cada aminoácido, multiplicar cada uno de dichos valores por un factor de escalación, y sumar dichos valores escalados para determinar dicha propensión a la agregación.

Método y aparato para evaluar la agregación de polipéptidos Campo Técnico Esta invención se refiere a métodos, y programas de computadora para determinación de las velocidades de agregación de los polipéptidos.

Antecedentes de la Técnica

Una comprensión de las propensiones a polipéptidos específicos a agregarse es de importancia crucial para dilucidar la base molecular de las enfermedades de deposición de proteínas, tales como la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades amiloides, y para comprender los mecanismos de acción de las mutaciones asociadas con formas hereditarias de tales enfermedades.

En cada una de las diversas condiciones patológicas asociadas con la deposición de proteínas y péptidos, un péptido o proteína específico que es normalmente soluble se deposita, sea intacto o en forma fragmentada, en agregados insolubles que se acumulan en uno o más tipos de tejido. Se ha encontrado que numerosas mutaciones están asociadas con formas familiares de enfermedades de deposición de proteínas y se ha demostrado que más de 100 implican directamente la secuencia del péptido o proteína responsable de la agregación (Siepen y Westhead, 2002) . Muchas de estas mutaciones se han identificado a lo largo de los últimos 5 años, y se espera que el número aumente espectacularmente en el futuro próximo. La investigación de los mecanismos por los cuales las mutaciones naturales dan como resultado comportamiento patológico ha demostrado ser de importancia fundamental para explorar la base molecular de la enfermedad subyacente, incluso en aquellos casos en los que las mismas tienen origen esporádico en lugar de familiar (Selkoe, 2001; Volles & Lansbur y , 2002) .

Se ha encontrado que la capacidad de formar agregados altamente organizados que tienen características estructurales comunes, tales como amiloides, es una propiedad genérica de los polipéptidos, con indiferencia de la semejanza de secuencia o de estructura, y no simplemente una característica de pequeños números de proteínas asociadas con condiciones patológicas reconocidas (Dobson, 2001) .

En el estado nativo, los residuos hidrófobos se incrustan usualmente en el centro de una proteína, por lo que la oportunidad de que estos residuos interaccionen es limitada. Sin embargo, las proteínas son dinámicas y existe un equilibrio entre la conformación estable y plegada, y estados desestabilizados, parcial o completamente desplegados. El valor de la energía libre (LG, kJ mol-1) para una proteína proporciona una indicación de la estabilidad de la proteína. La agregación ocurre cuando las proteínas en su estado nativo se desnaturalizan; a medida que la proteína se despliega, se rompen enlaces intramoleculares, permitiendo que queden al descubierto la cadena principal del polipéptido (columna vertebral) y cadenas laterales hidrófobas. Entonces pueden formarse enlaces de hidrógeno y otras interacciones entre las moléculas de proteína parcial o totalmente desnaturalizadas, dando como resultado asociaciones intermoleculares y formación de agregados.

En algunos casos, puede ser deseable que se formen agregados, en particular fibrillas, por ejemplo para uso como materiales plásticos, en electrónica, como conductores, para catálisis o como una forma de liberación lenta del polipéptido, o donde las fibrillas de polipéptido deben hilarse en un "hilo" de polipéptido para diversas aplicaciones; por ejemplo, como se describe en la solicitudes de patente publicadas WO 0017328 (Dobson) y WO 0242321 (Dobson & McPhee) .

Sin embargo, en otras circunstancias la formación de agregados es desventajosa, por ejemplo, cuando se desea utilizar un polipéptido a concentraciones o en condiciones deseables para actividad fisiológica, administración terapéutica o aplicación industrial. En particular, el uso de péptidos y proteínas bioactivos como agentes farmacéuticos es limitado en los casos en que el péptido o la proteína tiende a formar agregados durante la producción, el procesamiento, el almacenamiento o después de su administración. Estas cuestiones están plenamente reconocidas en la industria biotecnológica y farmacéutica y constituyen un problema y una carga económica importantes, que pueden ser difíciles de resolver y pueden requerir el uso de técnicas complejas de expresión y replegamiento, el desarrollo de formulaciones específicas, agentes estabilizadores y excipientes, suministro de cadena fría, o reconstitución inmediata antes de la utilización. Prácticamente la totalidad de los productos terapéuticos polipeptídicos conocidos presentan estos problemas, v.g. insulina, interferón-gamma, HMPs, calcitonina, glucagón, anticuerpos.

Se conocen diversos factores que afectan a la propensión a un polipéptido a agregarse. Algunos de estos factores son locales para residuos de aminoácidos, y otros factores son globales y pueden afectar a la proteína completa. Por ejemplo, cuando se producen mutaciones en un polipéptido, los factores locales en la región de la mutación tales como carácter hidrófobo incrementado, o propensión a la conversión de conformación de hélice a a lámina º, dan como resultado una velocidad de agregación mayor que la de la proteína del tipo salvaje (no mutante) . Los cambios "globales" o totales debidos a mutaciones pueden afectar también a la velocidad de agregación; por ejemplo, un cambio en la carga neta del polipéptido mutante que lo acerca a la neutralidad da como resultado una propensión incrementada de un polipéptido a la agregación. Las mutaciones que desestabilizan el estado nativo del polipéptido dan también como resultado una agregación facilitada.

Broome, B.H. & Hecht, M.H., Nature disfavours sequences of alternating polar, y Broome, amino Hecht, M.H., (Nature disfavours sequences of alternating polar and non-polar amino acids: Implications for Amyloidgenesis. J. Mol. Biol (2000) , 296, 961-968) describen un análisis de 250.514 secuencias de proteínas (79.708.024 residuos) para todos los patrones binarios posibles de residuos de aminoácidos polares y no polares. Los autores encontraron que existen patrones alternantes con una frecuencia significativamente menor que otros patrones con composiciones similares, y que esta infra-representación acoplada con la observación de que tales patrones promueven estructuras semejantes a amiloides en proteínas de novo sugiere que las secuencias de aminoácidos alternantes polares y no polares son inherentemente amiloidogénicas y por consiguiente están desfavorecidas por la selección evolutiva.

Un estudio detallado de mutaciones en una proteína modelo, la acilfosfatasa muscular (AcP) , demostró que la velocidad de agregación para un conjunto de conformaciones parcialmente desnaturalizadas puede seguirse fácilmente para AcP utilizando una diversidad de sondas espectroscópicas. Se determinó la velocidad de agregación para más de 50 variantes de mutación de esta proteína (Chiti et al., 2002a; 2002b: Chiti, F., Taddei, N., Baroni, F., Capanni, C., Stefani, M., Ramponi, G. & Dobson, C. M. Kinetic partitioning of protein folding and aggregation. Nature Struct. Biol. 9, 137-143 (2002a) ; Chiti, F., Calamai, M., Taddei, N., Stefani, M. Ramponi, G. & Dobson, C. M. Studies of the aggregation of mutant proteins in vitro provide insights into the genetics of amyloid diseases. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 99: 16419-16426 (2002b) ) . Se encontró que muchas de estas mutaciones, particularmente las que implican los residuos 16-31 y 87-98, perturban la velocidad de agregación de AcP muy significativamente (Chiti et al., 2002a; 2002b) . Chiti (2002a) llegó a la conclusión de que los cambios medidos en la velocidad de agregación después de mutación estaban correlacionados positivamente con cambios en la hidrofobicidad y la propensión a lámina º de las regiones de la proteína en las cuales están localizadas las mutaciones. Chiti (2002b) examinó mutaciones de AcP que alteraban el estado de carga de la proteína AcP sin afectar significativamente al carácter hidrófobo o las propensiones a estructura secundaria de la cadena polipeptídica. Se consignó una correlación inversa entre la velocidad de agregación de variantes proteínicas en condiciones desnaturalizantes y la carga neta global de la proteína.

Los factores que afectan a la velocidad de agregación de una proteína son diversos. Cuando se realizan sustituciones de aminoácidos en una proteína, se ven implicados varios factores en grados diferentes. Una mutación simple puede aumentar la carga neta, dificultando con ello la agregación (por ejemplo, el reemplazamiento de Ala por Asp en una proteína cargada positivamente)... [Seguir leyendo]

1. Un método de producción de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos, caracterizándose el método por determinar el perfil de una secuencia de aminoácidos introducida para identificar una parte de dicha secuencia de aminoácidos que se predice promueve la agregación de un polipéptido definido por dicha secuencia, comprendiendo el método:

determinar una propensión a la agregación para cada aminoácido de dicha secuencia introducida a fin de determinar un perfil de propensión a la agregación para dicha secuencia introducida; y comparar dichas propensiones a la agregación de dicho perfil de propensión a la agregación a fin de determinar una o más partes de dicha secuencia introducida que se predice promueven la agregación;

utilizar dichas una o más partes de dicha secuencia introducida que se predice promueven la agregación para diseñar un polipéptido modificado que es más o menos propenso a agregarse o que tiene una propensión a agregarse dentro de un intervalo deseado; y producir luego un polipéptido de acuerdo con el diseño; y en donde dicha determinación comprende determinar, para cada aminoácido de dicha secuencia, un valor de hidrofobicidad, y un valor de propensión a hélice a y/o lámina º, un valor de carga, y un valor patrón que representa un patrón de aminoácidos hidrófilos y/o hidrófobos en la proximidad de cada aminoácido, multiplicar cada uno de dichos valores por un factor de escalación, y sumar dichos valores escalados para determinar dicha propensión a la agregación.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual dicho patrón comprende un patrón de aminoácidos hidrófilos e hidrófobos alternantes.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el cual dicho patrón tiene una longitud de al menos 5 aminoácidos.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende adicionalmente modificar dicha secuencia de aminoácidos y repetir dicha determinación de la propensión a la agregación para identificar una o más partes de dicha secuencia que se predice promueven la agregación.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4 en el que dicha modificación comprende, para cada una de una pluralidad de posiciones en dicha secuencia de aminoácidos, seleccionar cada uno de una pluralidad de aminoácidos alternativos para dicha determinación de la propensión repetida.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5 que comprende adicionalmente comparar dichas propensiones a la agregación determinadas repetidamente a fin de identificar una o más partes de dicha secuencia que se predice promueven la agregación.

7. Un portador que lleva un código de programa de computadora para diseñar un polipéptido modificado que tiene una secuencia de aminoácidos por determinación del perfil de una secuencia de aminoácidos introducida a fin de identificar una parte de dicha secuencia de aminoácidos introducida que promueve la agregación de un polipéptido definido por dicha secuencia, comprendiendo el código codificar de tal modo que, cuando se corre en un programa de computadora, haga que el sistema de la computadora:

determine una propensión a la agregación para cada aminoácido de dicha secuencia introducida a fin de determinar un perfil de propensión a la agregación para dicha secuencia introducida;

comparar dichas propensiones a la agregación de dicho perfil de propensión a la agregación a fin de determinar una o más partes de dicha secuencia que se predice promueven la agregación; y utilizar una o más partes de dicha secuencia que se predice promueven la agregación para diseñar dicho polipéptido modificado, siendo dicho polipéptido modificado más o menos propenso a agregarse o teniendo una propensión a agregarse dentro de un intervalo deseado, en donde dicha determinación comprende determinar, para cada aminoácido de dicha secuencia, un valor de hidrofobicidad, un valor de propensión a hélice a y/o lámina º, un valor de carga, y un valor patrón que representa un patrón de aminoácidos hidrófilos y/o hidrófobos en la proximidad de cada uno de dichos aminoácidos, multiplicar cada uno de dichos valores por un factor de escalación, y sumar dichos valores escalados a fin de determinar dicha propensión a la agregación.

8. Un sistema de computadora para determinar el perfil de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido a fin de identificar una parte de dicha secuencia de aminoácidos que se predice promueve la agregación de un polipéptido definido por dicha secuencia, comprendiendo el sistema de la computadora:

un almacén de datos para almacenar para cada aminoácido de dicha secuencia, un valor de hidrofobicidad, un valor de propensión a hélice a y/o lámina º y un valor de carga, un almacén de programas que comprende el portador de la reivindicación 7; y un procesador, acoplado a dicho almacén de programas y a dicho almacén de datos para implementar dicho 5 código almacenado, comprendiendo el código adicionalmente un código para controlar el procesador a fin de:

introducir dicha secuencia de aminoácidos;

leer, para cada aminoácido de dicha secuencia, un dicho valor de hidrofobicidad, un dicho valor de propensión a hélice a y/o lámina º, y un dicho valor de carga, a partir de dicho almacén de datos;

determinar los datos de propensión a la agregación para cada aminoácido de dicha secuencia a partir 10 de dichos valores de hidrofobicidad, propensión a hélice a y/o lámina º, y carga y de dicho valor patrón; y emitir como salida dichos datos de propensión a la agregación a fin de identificar una parte de dicha secuencia que se predice promueve la agregación de un polipéptido asociado con la secuencia.

9. Un sistema de computadora de acuerdo con la reivindicación 8 que comprende adicionalmente un servidor de la 15 web.