Medios para cultivar microorganismos y método para producir ácidos grasos insaturados o lípidos que los contienen.

El uso, en un procedimiento para producir ácido graso insaturado o lípido que contiene tal ácido graso que comprende cultivar un microorganismo que pertenece al género Mortierella en un medio que contiene una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno, de un dicho medio que contiene iones fosfato, iones potasio, iones sodio, iones magnesio e iones calcio para controlar la morfología micelial del microorganismo Mortierella cultivado para que sea una mezcla de pulpa y gránulos, y en donde

(i) la fuente de nitrógeno contiene una o más fuentes de nitrógeno derivadas de sojas, iones fosfato en el intervalo de 5 a 60 mM, iones potasio en el intervalo de 5 a 60 mM, iones sodio en el intervalo de 2 a 50 mM, iones magnesio en el intervalo de 0,5 a 9 mM e iones calcio en el intervalo de 0,5 a 12 mM, o (ii) el medio contiene iones fosfato en el intervalo de 10 a 45 mM, iones potasio en el intervalo de 10 a 45 mM, iones sodio en el intervalo de 5 a 40 mM, iones magnesio en el intervalo de 1 a 6 mM e iones calcio en el intervalo de 1 a 9 mM.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP1997/004898.

Solicitante: SUNTORY HOLDINGS LIMITED.

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 1-40, Dojimahama 2-chome, Kita-ku Osaka-shi Osaka 530-8203 JAPON.

Inventor/es: HIGASHIYAMA, KENICHI, AKIMOTO, KENGO, SHIMIZU, SAKAYU, YAGUCHI, TOSHIAKI.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos orgánicos que contienen... > C12P7/64 (Grasas; Aceites; Ceras de tipo éster; Acidos grasos superiores, es decir, con una cadena lineal de al menos siete átomos de carbono unida a un grupo carboxilo; Aceites o grasas oxidadas)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/14 (Microorganismos fúngicos (cultivo de setas A01G 1/04; como novedades vegetales A01H 15/00 ); Sus medios de cultivo)

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Fragmento de la descripción:

Medios para cultivar microorganismos y método para producir ácidos grasos insaturados o lípidos que los contienen

Campo técnico

La presente invención se refiere al uso de un medio de cultivo para cultivar un microorganismo, en un procedimiento 5 para producir un lípido que contiene ácidos grasos insaturados que se puede obtener cultivando un microorganismo que pertenece al género Mortierella capaz de producir ácidos grasos insaturados en dicho medio.

Antecedentes de la técnica Se dice que el ácido araquidónico, el ácido dihomo-γ-linolénico, el ácido eicosapentaenoico, el ácido de Mead y similares son precursores de prostaglandinas, tromboxanos, prostaciclinas, leucotrienos y similares, que tienen 10 potentes y diversas actividades biológicas, y por lo tanto están atrayendo mucha atención en los últimos años. Por ejemplo, se ha hecho un rápido progreso en el estudio del ácido araquidónico, como del ácido docosahexaenoico (DHA) como un ingrediente esencial, especialmente para el crecimiento de los niños; Lanting et al. han llevado a cabo un estudio de seguimiento sobre niños criados con leche materna y los criados con fórmula para lactantes durante tres semanas o más después del nacimiento hasta que crecieron hasta la edad de nueve años en cuanto a la incidencia de trastornos menores en los nervios cerebrales en base a sus aspectos conductuales, etc., y han reportado que la incidencia de trastornos cerebrales en los niños criados con fórmula para lactantes es dos veces más alta que la de los niños criados con leche materna (LANCET, vol. 344, 1319-1322 (1994) ) .

Se ha especulado que este impactante resultado es debido a la posibilidad de que tales ácidos grasos insaturados, como DHA y ácido araquidónico, que están presentes en la leche materna pero no en la fórmula para lactantes,

pueden estar asociados con el desarrollo del cerebro. Desde entonces, han aparecido muchos informes que sugieren la asociación de ácidos grasos insaturados con el desarrollo del cerebro y la retina en los niños, lo que está atrayendo la atención como tema más reciente en el campo de la nutrición para prematuros y recién nacidos.

Estos ácidos grasos insaturados aparecen ampliamente en el reino animal: por ejemplo, el ácido araquidónico ha sido aislado de un lípido que se extrajo de la glándula adrenal o el hígado de animales. El contenido de ácidos 25 grasos insaturados en los mismos, sin embargo, es bajo, y fue insuficiente para su suministro a gran escala, y por lo tanto se han ideado diversos métodos para obtener ácidos grasos insaturados cultivando diversos microorganismos. Entre otros, se sabe que los microorganismos que pertenecen al género Mortierella producen ácidos grasos insaturados tales como ácido araquidónico, ácido dihomo-γ-linolénico, ácido eicosapentaenoico, ácido de Mead y similares, y por tanto se han desarrollado métodos que producen dichos ácidos grasos insaturados por el método de fermentación usando estos microorganismos (documentos JP-A-63 (1998) -44891 y EP-A-0276541, JP-A-63 (1998) 12290 y EP-A-0223960, JP-A-63 (1998) -14696 y JP-A-63 (1988) -14697, correspondientes a EP-A-0252716.

También se conoce un método para producir ácido de Mead usando una cepa mutante en la que la actividad desaturante de Δ12 ha sido reducida o hecha defectiva, que se puede obtener sometiendo un microorganismo del género Morteriella a un tratamiento de mutación (documentos JP-A-5 (1993) -91888 y EP-A-0535939) .

Además, también se conoce un método para producir ácido dihomo-γ.linolénico usando una cepa mutante en la que la actividad desaturante de Δ5 ha sido reducida o hecha defectiva, que se puede obtener sometiendo un microorganismo del género Morteriella a un tratamiento de mutación (documentos JP-A-5 (1993) -91887 y EP-A0535940) .

Sin embargo, cuando se lleva a cabo una producción por fermentación en un medio líquido usando un hongo filamentoso como el género Mortierella, el crecimiento celular da como resultado a menudo el aumento de la viscosidad del medio de cultivo líquido y la consiguiente reducción del suministro de oxígeno. Aunque un método (documento JP-A-6 (1994) -153970) de regulación del oxígeno disuelto, desarrollado para vencer los inconvenientes anteriores, ha jugado un importante papel en la mejora de la productividad, no es suficiente para lograr una alta productividad que sea económicamente excelente a escala industrial. Por ello, es imperativo el desarrollo extensivo 45 de técnicas de cultivo que incluyan la búsqueda de medios de cultivo y nutrientes traza más baratos, y un método para regular la morfología micelial para mejorar la fluidez del medio de cultivo líquido.

Como estrategia para tal desarrollo tecnológico, se está investigando el efecto de añadir sales como nutrientes traza sobre la morfología micelial. Hay diversos informes sobre el efecto de añadir iones tales como potasio, sodio, calcio, magnesio y ácido fosfórico entre otros (solicitud de patente internacional WO96/21037, documentos JP-A-8 (1996) 50 214893 y EP-A-0726321, Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol. 39, p. 450 (1993) , Biotechnology Lett., Vol. 12, No. 6, p. 455 (1990) , Yukagaku (Oil Chemistr y ) Vol. 37, No. 3, p. 241 (1989) , Yukagaku (Oil Chemistr y ) Vol. 42, No. 11, p. 893 (1993) ) . Por otra parte, sin embargo, estos informes no investigaron el efecto de aumentar de manera más agresiva la productividad de ácidos grasos insaturados añadiendo estos iones principales a concentraciones de 0, 5 mM o superiores, excediendo el concepto de ser suplementos nutricionales, ni investigaron siquiera los efectos que tiene el

equilibrio de los iones añadidos sobre la morfología micelial y las composiciones de los lípidos. Se desea, por lo tanto, optimizar el método de añadir iones.

El documento EP-A-0125764 describe un cultivo de Mortierella productor de lípidos, específicamente M. isabellina,

M. vinacea, M. ramanniana var. anglispora o M. nana, en un medio que contiene por litro de agua 2 g de KH2PO4, 0, 3 g de MgSO4·7H2O, 0, 1 g de NaCl, 0, 2 g de extracto de malta, 0, 2 g de extracto de lavadura y 0, 1 g de peptona. La fuente de carbono fue glucosa o melazas, las fuentes de nitrógeno alternativas sulfato de amonio o urea.

El documento EP-A-0726321, mencionado anteriormente, describe producir aceite que contiene ARA cultivando M. schmuckeri, del que se dice que toma una morfología filamentosa dispersa durante el cultivo (distinta a gránulos) mejorando así el crecimiento y la productividad. El medio de cultivo usa preferiblemente una fuente de nitrógeno compleja tal como licor de maíz fermentado, hidrolizado de proteínas o biomasa, tona de soja, harina de soja, harina de pescado o de carne, peptona, triptona, extracto de levadura, levadura o suero de leche. Se pueden añadir sales inorgánicas y metales traza, pero se recomienda una baja concentración de magnesio para mejorar la producción. Un ejemplo usa medio M-3, que comprende 12 g/l de harina de soja, 0, 1 g/l de MgSO4·7H2O, 0, 1 g/l de CaCO3, aditivos de metales traza, 1 ml/l de mezcla de vitaminas, 2 g/l de KH2PO4 y 43, 8 g/l de glucosa.

La solicitud de patente internacional WO96/21037, mencionada anteriormente, describe producir aceite que contiene ARA cultivando M. alpina. Algunos ejemplos usan glucosa y extracto de levadura sin aditivos minerales. Se advirtió la formación gradual de gránulos de biomasa después de la inoculación. Otros ejemplos suplementan con sales de Fe, Zn y Cu, a veces KH2PO4 también. El medio del Ejemplo 7 fue 80 g/l de dextrosa, 16 g/l de harina de soja, 30 mg/l de FeCl3·6H2O, 1, 5 mg/l de ZnSO4·7H2O, 0, 1 mg/l de CuSO4·5H2O y vitaminas. Se añadieron más tarde 2 g/l de KH2PO4.

Kendrick y Routledge, en... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. El uso, en un procedimiento para producir ácido graso insaturado o lípido que contiene tal ácido graso que comprende cultivar un microorganismo que pertenece al género Mortierella en un medio que contiene una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno, de un dicho medio que contiene iones fosfato, iones potasio, iones sodio, iones magnesio e iones calcio para controlar la morfología micelial del microorganismo Mortierella cultivado para que sea una mezcla de pulpa y gránulos, y en donde (i) la fuente de nitrógeno contiene una o más fuentes de nitrógeno derivadas de sojas, iones fosfato en el intervalo de 5 a 60 mM, iones potasio en el intervalo de 5 a 60 mM, iones sodio en el intervalo de 2 a 50 mM, iones magnesio en el intervalo de 0, 5 a 9 mM e iones calcio en el intervalo de 0, 5 a 12 mM, o (ii) el medio contiene iones fosfato en el intervalo de 10 a 45 mM, iones potasio en el intervalo de 10 a 45 mM, iones sodio en el intervalo de 5 a 40 mM, iones magnesio en el intervalo de 1 a 6 mM e iones calcio en el intervalo de 1 a 9 mM.

2. Uso según la reivindicación 1, opción (ii) , en el que dicha fuente de nitrógeno se selecciona de: fuentes de nitrógeno derivadas de sojas, peptona, extracto de levadura, extracto de malta, extracto de carne, ácido casamínico, 15 licor de maíz fermentado, urea, nitrato de amonio, sulfato de amonio.

3. Uso según la reivindicación 2, en el que el medio contiene una fuente de nitrógeno derivada de sojas, sola o en combinación con otra dicha fuente de nitrógeno.

4. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la fuente de nitrógeno derivada de sojas

proporciona un contenido de nitrógeno de al menos 2% en peso con respecto a los componentes totales distintos al 20 agua.

5. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha fuente de nitrógeno derivada de sojas es al menos una seleccionada de sojas desgrasadas, sojas no desgrasadas, y productos procesados de estas.

6. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que contiene una fuente de carbono seleccionada

de glucosa, fructosa, xilosa, sacarosa, maltosa, almidón soluble, melazas, glicerol, manitol, ácido cítrico y almidón de 25 maíz.

7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el procedimiento es para producir un lípido microbiano que contiene el ácido graso insaturado, y en donde el porcentaje de triglicéridos en el lípido microbiano producido es 90% o superior.

8. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las sales que proporcionan dichos iones

fosfato, potasio, sodio, magnesio y calcio se añaden hacia el final del crecimiento logarítmico de los microorganismos.

9. Uso según la reivindicación 8, en el que dichas sales se añaden hacia la mitad del crecimiento logarítmico de los microorganismos.

10. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho ácido graso insaturado se

selecciona de ácido araquidónico, ácido γ-linolénico, ácido dihomo-γ-linolénico, ácido de Mead y ácido eicosapentaenoico.

11. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho microorganismo es Mortierella alpina, Mortierella elongata, Mortierella exigua o Mortierella hygrophila.