MEDIO DE CULTIVO PARA LA DETECCION DE LAS BACTERIAS DEL GENERO LISTERIA.

Medio de cultivo sólido para la detección y/o la discriminación de bacterias del género Listeria,

caracterizado porque comprende, en un medio de cultivo de Listeria, por lo menos un agente cromógeno seleccionado de entre los sustratos de la a-manosidasa, y porque dicho agente cromógeno libera mediante hidrólisis un cromóforo precipitable seleccionado de entre los derivados indoxilo, halógeno-indoxilo (bromo-indoxilo, cloro-indoxilo, fluoro-indoxilo, yodo-indoxilo, dicloro-indoxilo, cloro-bromo-indoxilo, tri-cloro-indoxilo), metil-indoxilo, o hidroxi-quinolina

Medio de cultivo para la detección de las bacterias del género Listeria.

La presente invención se refiere a un medio de cultivo cromógeno destinado a poner en evidencia las bacterias del género Listeria, en particular Listeria monocytogenes, siendo dicho medio un medio de cultivo sólido para la detección y/o la discriminación de bacterias del género Listeria, caracterizado porque comprende, en un medio de cultivo de Listeria, por lo menos un agente cromógeno seleccionado de entre los sustratos de la a-manosidasa, y porque dicho agente cromógeno libera mediante hidrólisis un cromóforo precipitable seleccionado de entre los derivados indoxilo, halógeno-indoxilo (bromo-indoxilo, cloro-indoxilo, fluoro-indoxilo, yodo-indoxilo, dicloro-indoxilo, cloro-bromo-indoxilo, tri-cloro-indoxilo), metil-indoxilo, o hidroxi-quinolina.

Tanto en el campo clínico como en el campo agroalimentario, la búsqueda de Listeria, y en particular de Listeria monocytogenes es cada vez más importante, debido a que estas bacterias están diseminadas frecuentemente en unos productos agroalimentarios y conducen a unas infecciones graves en los pacientes sensibles (embarazadas, personas mayores, etc.).

De hecho, desde hace unos años, los gobiernos implantan unas redes de vigilancia cada vez más estrictas, en particular para los productos de la industria agroalimentaria. Así, se observa una generalización de la vigilancia epidemiológica de Listeria monocytogenes.

Por lo tanto, es importante disponer de un ensayo fiable y rápido que permita detectar las contaminaciones por estas bacterias, ensayo que debe de ser al mismo tiempo sensible y específico.

Existen hoy en día ciertos medios de cultivo para la detección de Listeria, tales como el PALCAM o el medio OXFORD más o menos selectivos que permiten detectar la presencia de Listeria en unas muestras. Los resultados obtenidos utilizando estos medios pueden presentar ciertas imprecisiones que implican la necesidad de efectuar otros ensayos para confirmar la presencia de L. monocytogenes.

Estos medios se basan en efecto en una combinación de antimicrobianos que aportan una selectividad y la detección de enzimas que aportan una especificidad. Sin embargo, al mismo tiempo la selectividad y la especificidad de estos medios pueden ser mejoradas, puesto que conducen en particular a la presencia de numerosos falsos positivos o falsos negativos. Una desventaja de estos medios es que no permiten la distinción de la especie L. monocytogenes.

Existen asimismo unos medios que incluyen un ensayo que se basa en la detección de fosfolipasas para detectar directamente L. monocytogenes mediante una coloración específica de la colonia o mediante un halo específico que rodea la colonia. Así, Restaino et al. (J Food Prot. marzo de 1999; 62(3): 244-51) describe un procedimiento de detección y/o de discriminación de las bacterias del género Listeria que comprende un medio de cultivo de Listeria que contiene un sustrato cromógeno y fluorógeno específico de identificación de la enzima fosfatidilinositol fosfolipasa C (PI-PLC). Sin embargo, estos ensayos son asimismo positivos para L. ivanovii, que presenta asimismo un carácter fosfolipasa +.

Se sugería diferenciar L. monocytogenes de L. ivanovii en una etapa de identificación según la etapa de aislamiento, utilizando en particular un ensayo basado en una diferencia en un fenotipo "aminopeptidasa".

Así, la patente US nº 5.330.889 se refiere a un procedimiento y a un medio de identificación de bacterias del género Listeria y en particular Listeria monocytogenes, comprendiendo dicho medio un sustrato cromógeno o fluorógeno capaz de ser hidrolizado por una glicina aminopeptidasa.

Por otro lado, Kämpfer (J Clin Microbiol. mayo de 1992; 30(5):1097-71) describe la utilización de un medio líquido que comprende un sustrato de la a-manosidasa para la detección de bacterias del género Listeria. La composición específica del medio utilizado se da a conocer en Kämpfer et al (J Clin Microbiol. diciembre de 1991; 29(12):2877-9), siendo el sustrato de la a-manosidasa utilizado el agente fluorógeno 4-metilumbeliferil-a-D-manopiranósido, que no es precipitable. Al contrario, es capaz de difundirse en el interior del medio sólido y por lo tanto no se puede utilizar en medio sólido.

Kerr et al. (J Med Microbiol. octubre de 1991; 35(4):193-6) describe asimismo la utilización de un medio líquido que comprende un sustrato de la a-manosidasa para la detección de bacterias del género Listeria. En este caso, el sustrato de la a-manosidasa utilizado es el p-nitrofenil-a-D-manopiranósido, que tampoco es precipitable, pero que por el contrario, es capaz de difundirse en el interior del medio sólido y por lo tanto no se puede utilizar en medio sólido.

Con el fin de diferenciar L. monocytogenes de L. ivanovii, la presente invención se basa en la detección de la alfa manosidasa, un carácter positivo para L. monocytogenes y negativo para L. ivanovii. Este carácter puede ser revelado por ejemplo en unos cultivos puros con la ayuda del sustrato enzimático nitrofenil-a-manósido, que es incoloro y que libera un nitrofenilo coloreado en amarillo cuando el ensayo es positivo.

La presente invención demuestra que se puede revelar la a-manosidasa a nivel de las colonias sobre medio sólido detectando la a-manosidasa con un sustrato cromógeno en el medio sólido. La utilización de un sustrato de la a-manosidasa en un medio sólido, descrita por primera vez en la presente solicitud, presenta en particular la ventaja de preparar unos medios sólidos en los que se pueden diferenciar a partir del aislamiento, sin tener que efectuar unos ensayos suplementarios, L. monocytogenes de L. ivanovii.

Así, la presente invención se refiere a un nuevo medio de cultivo sólido, para la detección y/o la discriminación de bacterias del género Listeria, caracterizado porque comprende, en un medio de cultivo de Listeria, por lo menos un agente cromógeno seleccionado de entre los sustratos de la a-manosidasa, y porque dicho agente cromógeno libera mediante hidrólisis un cromóforo precipitable seleccionado de entre los derivados indoxilo, halógeno-indoxilo (bromo-indoxilo, cloro-indoxilo, fluoro-indoxilo, yodo-indoxilo, dicloro-indoxilo, cloro-bromo-indoxilo, tri-cloro-indoxilo), metil-indoxilo, o hidroxi-quinolina. Así, la colonia bacteriana se colorea en función del cromóforo liberado, siendo el cromóforo liberado sólido en el medio de cultivo, y permaneciendo por lo tanto localizado a nivel de la colonia en la que ha sido liberado.

Unos derivados preferidos se seleccionan en particular de entre los derivados siguientes: 6-cloro-indoxilo, 5-bromo-indoxilo, 3-bromo-indoxilo, 6-fluoro-indoxilo, 5-yodo-indoxilo, 4,6-dicloro-indoxilo, 6,7-dicloro-indoxilo, 5-bromo-4-cloro-indoxilo, 5-bromo-6-cloro-indoxilo, 4,6,7-tricloro-indoxilo, N-metil-indoxilo y 8-hidroxi-quinolina.

De manera preferida, el sustrato de la a-manosidasa es el indoxil-a-manósido. La concentración del agente cromógeno en el medio está comprendida entre aproximadamente 0,01 y 0,5 g/l. Una concentración preferida es 0,05 g/l.

Asimismo, puede ser interesante añadir un activador de reacción coloreado, en el medio, con el fin de mejorar la calidad de la reacción observada. Un activador apropiado para dicha utilización es el metil-a-manósido, que se integra en el medio a una concentración comprendida entre aproximadamente 0,01 y 0,5 g/l, preferentemente 0,25 g/l.

El medio según la presente invención permite así detectar L. monocytogenes, y discriminar esta bacteria con relación a L. ivanovii, sin efectuar ningún ensayo suplementario. Con el fin de optimizar los resultados proporcionados por el medio según la invención, puede ser interesante añadir unos factores selectivos para Listeria, tal como se utiliza en los medios de la técnica anterior. Se obtiene por lo tanto un medio específico para L. monocytogenes.

La invención tiene asimismo por objeto la utilización de un medio de cultivo según la invención para la detección y/o la discriminación de las bacterias del género Listeria, en particular L. monocytogenes.

La presente invención tiene asimismo por objeto un procedimiento de detección y/o de discriminación de las bacterias del género Listeria...

1. Medio de cultivo sólido para la detección y/o la discriminación de bacterias del género Listeria, caracterizado porque comprende, en un medio de cultivo de Listeria, por lo menos un agente cromógeno seleccionado de entre los sustratos de la a-manosidasa, y porque dicho agente cromógeno libera mediante hidrólisis un cromóforo precipitable seleccionado de entre los derivados indoxilo, halógeno-indoxilo (bromo-indoxilo, cloro-indoxilo, fluoro-indoxilo, yodo-indoxilo, dicloro-indoxilo, cloro-bromo-indoxilo, tri-cloro-indoxilo), metil-indoxilo, o hidroxi-quinolina.

2. Medio de cultivo según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho agente cromógeno libera, mediante hidrólisis, un cromóforo precipitable seleccionado de entre los derivados 6-cloro-indoxilo, 5-bromo-indoxilo, 3-bromo-indoxilo, 6-fluoro-indoxilo, 5-yodo-indoxilo, 4,6-dicloro-indoxilo, 6,7-dicloro-indoxilo, 5-bromo-4-cloro-indoxilo, 5-bromo-6-cloro-indoxilo, 4,6,7-tricloro-indoxilo, N-metil-indoxilo u 8-hidroxi-quinolina.

3. Medio de cultivo según una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque dicho medio contiene asimismo un activador de reacción coloreado.

4. Medio de cultivo según la reivindicación 3, caracterizado porque dicho activador es el metil-a-manósido.

5. Medio de cultivo según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque comprende además unos factores selectivos para Listeria.

6. Medio de cultivo según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el sustrato de la a-manosidasa es el indoxil-a-manósido.

7. Medio de cultivo según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque comprende (para un litro):

8. Medio de cultivo según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque es específico de L. monocytogenes.

9. Utilización de un medio de cultivo según una de las reivindicaciones 1 a 8, para la detección y/o la discriminación de las bacterias del género Listeria.

10. Procedimiento de detección y/o de discriminación de las bacterias del género Listeria en una muestra, caracterizado porque comprende las etapas que consisten en: