Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España en los últimos 80 años. Clasificación Internacional de Patentes CIP 2013.

MATERIALES Y METODOS PARA ALTERAR UNA RESPUESTA INMUNOLOGICA A INMUNOGENOS EXOGENOS Y ENDOGENOS, INCLUYENDO CELULAS, TEJIDOS U ORGANOS SINGENEICOS Y NO SINGENEICOS.

Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen:

Un material implantable, que comprende una matriz biocompatible y células endoteliales ancladas o incluidas

, células de tipo endotelial o sus análogos para ser usado en la reducción de una respuesta inmune o una reacción inflamatoria en un método que comprende la etapa de proporcionar dicho material implantable a un receptor en una cantidad suficiente para reducir la respuesta inmune o la reacción inflamatoria en dicho receptor, en que la matriz tiene una configuración tridimensional de forma que las células ancladas y/o incluidas pueden crear y ocupar un hábitat multi-dimensional.

Solicitante: MASSACHUSETTS INSTITUTE OF TECHNOLOGY
PERVASIS THERAPEUTICS, INC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: FIVE CAMBRIDGE CENTER, KENDALL SQUARE,CAMBRIDGE, MA 02142-1493.

Inventor/es: EDELMAN, ELAZER, R., NUGENT,HELEN,MARIE, METHE,HEIKO.

Fecha de Publicación de la Concesión: 25 de Octubre de 2010.

Fecha Concesión Europea: 9 de Junio de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes: C12N5/06B28, A61K39/00D5.

Clasificación PCT: A61K35/12 (.Sustancias que provienen de mamíferos o de pájaros [2]), C12N5/071.

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MATERIALES Y METODOS PARA ALTERAR UNA RESPUESTA INMUNOLOGICA A INMUNOGENOS EXOGENOS Y ENDOGENOS, INCLUYENDO CELULAS, TEJIDOS U ORGANOS SINGENEICOS Y NO SINGENEICOS.
Descripción:

Materiales y métodos para alterar una respuesta inmunológica a inmunógenos exógenos y endógenos, incluyendo células, tejidos u órganos singeneicos y no singeneicos.

Campo de la invención

Esta invención se dirige a materiales y métodos para modular una respuesta inmunológicamente adversa a un inmunógeno exógeno o endógeno, que incluye un inmunógeno asociado a células, tejidos u órganos. Por ejemplo, la presente invención puede modular una reacción de respuesta inmune o inflamatoria adversa a inmunógenos exógenos o endógenos, que incluyen células, tejidos u órganos no singeneicos o singeneicos, así como para mejorar un estado autoinmune.

Antecedentes de la invención

La investigación sobre xenotrasplantes se ha intensificado durante los últimos años para aliviar la escasez de órganos. Sin embargo, las respuestas inmunes de los hospedantes presentan una enorme barrera para el trasplante entre las especies. Aunque los anticuerpos naturales provocan un rechazo inmediato de estos trasplantes discordantes, la lesión de células endoteliales (EC) y la activación de los vasos injertados que recubren las EC desempeñan una función clave en el inicio del rechazo crónico de injertos. La interrupción de la integridad de la capa endotelial tiene una importancia indudable en numerosos estados, que incluye en trasplantes de tejidos singeneicos y no singeneicos así como enfermedades infecciosas, neoplásticas, inflamatorias y cardiovasculares.

Hasta ahora la inmunomodulación y la aceptación de los trasplantes ha requerido una dependencia de agentes inmunosupresores administrados por vía sistémica. Aunque estos agentes permiten algún grado de aceptación del trasplante, el éxito es limitado y quizás, de forma más significativa, el sistema inmune del paciente queda profundamente comprometido como consecuencia de estos agentes. Por tanto, continúa habiendo una necesidad de materiales terapéuticos y paradigmas de tratamiento que puedan conseguir la ausencia de una inmunomodulación y de efectos de toxicidad y adversos en el sistema inmune de un paciente.

Análogamente, los inmunógenos o estímulos exógenos han planteado un desafío clínico. También, estos pueden dar lugar a acontecimientos inmunológicos adversos o reacciones inflamatorias que necesitan un tratamiento.

Hasta ahora, la gestión clínica de estos acontecimientos adversos se ha basado casi exclusivamente en tratamientos con agentes farmacéuticos que suprimen el sistema inmune de forma no específica.

Las enfermedades autoinmunes y otras enfermedades similares, sin embargo, son otra manifestación clínica de reacciones inflamatorias destacadas o respuestas inmunes adversas. La gestión satisfactoria de estas enfermedades se ha escapado a los facultativos hasta ahora.

Un objeto de la presente invención es proporcionar una solución de ingeniería de tejidos para conseguir una inmunomodulación sin basarse en productos químicos o farmacéuticos que comprometan el sistema inmune de un paciente. Esta solución de ingeniería de tejidos puede ser empleada para alterar, de una manera clínicamente práctica, una respuesta inmune para inmunógenos exógenos y endógenos, que incluyen inmunógenos asociados a células, tejidos u órganos no singeneicos así como singeneicos. Otro objeto de la presente invención es facilitar la aceptación de un paciente de células, tejidos u órganos no singeneicos así como singeneicos. Otro objeto de la presente invención es emplear esta solución de ingeniería de tejidos para modular una reacción inflamatoria como la asociada a lesiones y diversas enfermedades. Otro objeto es utilizar los materiales y métodos de la presente invención para gestionar enfermedades de autoinmunidad y relacionadas.

Nugent et al. (2002) Journal of Vascular Research 39(6): 524-533 describen la implantación de implantes endoteliales alógenos que comprenden una matriz tridimensional basada en colágeno en la que se han sembrado células endoteliales aórticas porcinas y el uso de dichos implantes para inhibir la hiperplasia íntima.

Nugent et al. (1999) Circulation Research 84(4): 384-391 describen la sembradura de células endoteliales aórticas bovinas y porcinas en una matriz tridimensional de colágeno y el uso de la matriz sembrada como un implante para inhibir la hiperplasia íntima.

Sumario de la invención

La presente invención explota el descubrimiento de que las células ancladas y/o incluidas en una matriz biocompatible, preferentemente una que tenga una configuración tridimensional, pueden modular una respuesta inmunológicamente adversa o una reacción inflamatoria respecto a cualquier inmunógeno exógeno o endógeno. Inmunógeno incluye cualquier inmunógeno singeneico o no singeneico, que incluye un inmunógeno asociado a células, tejidos u órganos, así como lesiones, enfermedades y estímulos medioambientales.

La presente invención proporciona un material implantable como se describe en las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A, 1B y 1C exponen gráficamente los niveles de anticuerpos específicos PAE en circulación según una realización ilustrativa de la inven- ción.

La Figura 2 expone gráficamente la actividad lítica de esplenocitos según una realización ilustrativa de la invención.

La Figura 3A expone gráficamente las frecuencias de células productoras de citoquinas según una realización ilustrativa de la invención.

La Figura 3B expone pocillos ELISPOT representativos según una realización ilustrativa de la invención.

La Figura 3C expone gráficamente las frecuencias de células T según una realización ilustrativa de la invención.

Las Figuras 4A y 4B representan gráficamente los niveles de células efectoras según una realización ilustrativa de la invención.

Las Figuras 5A, 5B y 5C exponen gráficamente niveles de anticuerpos según una realización ilustrativa de la invención.

La Figura 6 expone gráficamente niveles de esplenocitos según una realización ilustrativa de la invención.

Las Figuras 7A y 7B exponen gráficamente niveles de anticuerpos según una realización ilustrativa de la invención.

Las Figuras 8A y 8B exponen gráficamente la frecuencia de células productoras de citoquinas según una realización ilustrativa de la invención.

Las Figuras 9A y 9B exponen gráficamente niveles de células efectoras según una realización ilustrativa de la invención.

Las Figuras 10A y 10B exponen correlaciones entre la frecuencia esplenocitos productores de citoquinas Th2 y el alcance de la diferenciación de células T en células efectoras según una realización ilustrativa de la invención.

La Figura 11 expone gráficamente el grado de deterioro de células endoteliales según una realización ilustrativa de la invención.

Las Figuras que hacen referencia a PAE, HAE o EC "incluidas" o "incluidas en matrices" significan PAE, HAE o EC ancladas a matrices y/o incluidas en una matriz.

Descripción detallada de la invención

La ingeniería de tejidos es una aproximación prometedora para explotar células endoteliales, células de tipo endotelial o análogos de una terapia celular para enfermedades acompañadas de componentes inmunológicos adversos o tipificadas como tales. Por ejemplo, ciertas enfermedades como, pero sin limitación, las enfermedades vasculares, provocan respuestas inmunológicas adversas y/o reacciones inflamatorias. La presente invención se basa en el descubrimiento de que las células como las células endoteliales, que son ancladas o incluidas en matrices tridimensionales, secretan factores reguladores esenciales que pueden mejorar o modular de algún otro modo una respuesta inmunológica adversa.

El material implantable de la presente invención se desarrolló sobre los principios de la ingeniería de tejidos y representa una nueva aproximación para abordar las necesidades clínicas descritas en la presente memoria descriptiva. El material implantable de la presente invención es único en cuanto que las células viables ancladas y/o incluidas en la matriz biocompatible son capaces de suministrar al sitio de administración múltiples productos basados en células en proporciones fisiológicas bajo un control de la retroalimentación fisiológica. Como se describe en otro lugar en la presente memoria descriptiva, las células adecuadas para ser usadas con el material implantable son células endoteliales o de tipo endotelial, o análogas de cada una de las que anteceden. El suministro local de múltiples compuestos por estas células y una dosificación fisiológicamente dinámica proporcionan una regulación más eficaz de los procedimientos responsables de modular una respuesta inmune. El material implantable de la presente invención puede proporcionar un entorno que emule la fisiología de soporte y conduzca a la modulación de una respuesta inmune.

Esto es un descubrimiento inesperado ya que las células endoteliales pueden desempeñar una función clave en el inicio de respuestas alo- y xeno-inmune adversas. Además de ello, las células endoteliales pueden activar células T a través de procedimientos mediados por antígenos y la activación de células T puede modificar la función crucial de las células endoteliales, incluida la presentación de antígenos a través de la activación por citoquinas, contribuyendo así a una respuesta inmune adversa. Las células endoteliales expresan constitutivamente moléculas de complejo de histocompatibilidad principal (MHC) de clase I y el IFN-? puede inducir células endoteliales para expresar moléculas de MHC clase II que les permite proporcionar señales dependientes de antígeno a células T CD8+ y CD4+ a través de la trayectoria directa. Las células endoteliales puede proporcionar también principalmente la co-estimulación a células T. Además la capacidad de capturar células T a través de la expresión endotelial de moléculas de adhesión permite la formación de zonas de contacto que favorece la respuesta inmune adversa en la forma de inflamación. Además de ello, la autoinmunidad puede exacerbar una enfermedad vascular, en particular en la forma de anticuerpos de células anti-endoteliales. La morbilidad destacada de las enfermedades cardiovasculares conjuntamente con la diabetes mellitus, hipertensión y otros estados de enfermedad refleja la presencia y potencia aumentadas de estos anticuerpos.

Por el contrario, como se describe en la presente memoria descriptiva, las células endoteliales ancladas y/o incluidas en matrices, cuando son implantadas en un hospedante actúan como reguladores potentes del sistema inmune, como lo indica una reducción significativa en la respuesta inmune sistémica y/o la inflamación esperada. Como se ilustra en la presente memoria descriptiva, la capacidad de estas sales para mejorar o modular la respuesta inmune ha sido demostrada comparando la respuesta inmune frente a células endoteliales ancladas y/o incluidas en matrices frente a las libres en ratones sin inmunizar así como en ratones con reactividad inmune de células endoteliales destacada. Las células endoteliales asociadas a matrices, como se describen en la presente memoria descriptiva, proporcionan una protección inmune a múltiples niveles; las células endoteliales humanas y porcinas demuestran una considerable reducción de moléculas de clase MHC elaboradas; moléculas co-estimuladoras y moléculas de adhesión cuando son ancladas y/o incluidas en matrices como se describe en la presente memoria descriptiva.

El anclaje y/o la inclusión en matrices de células endoteliales puede tener también una influencia sobre la formación de una memoria inmunológica, como se ilustra en la presente memoria descriptiva. Mientras que la reimplantación de sedimentos de células endoteliales en suspensión en solución salina libres o como sedimentos situados adyacentes a matrices vacía provocó una xeno-respuesta humoral y celular aumentada significativa, los ratones nuevamente estimulados con células endoteliales ancladas y/o incrustadas en matrices condujeron a una capacidad lítica reducida de esplenocitos sin aumentar las respuestas inmunes humorales. Además de ello, resultó evidente un desplazamiento ligero en el equilibrio Th1/Th2 hacia el primero en los ratones que recibieron células endoteliales xenogénicas ancladas y/o incluidas en matrices.

Por tanto, la introducción de células endoteliales libres adyacentes a matrices vacía no consiguió reducir la respuesta inmune del hospedante, indicando la importancia de un anclaje y/o inclusión en matriz. El fallo de las células endoteliales ancladas y/o incluidas para expresar MHC II, co-estimuladoras y moléculas de adhesión tras la estimulación podría suponer la diferenciación atenuada de células T en células efectoras en respuesta a células endoteliales xenogenicas ancladas y/o incluidas en matrices implantadas. Como se explica en la presente memoria descriptiva, la activación de esplenocitos de ratones es mutada cuando es expuesta a células endoteliales xenogeneicas ancladas y/o incluidas en matrices de una manera dependiente de las MHC clase II.

Globalmente, la naturaleza isotrópica de las células endoteliales contribuye a esta forma única de inmunomodulación en la que el anclaje y/o inclusión de células en una matriz adecuada proporciona una inmunoprotección a través del aislamiento o enmascaramiento de antígenos críticos. Está bien reconocido que la función de las células endoteliales in vivo es dependiente del anclaje y la densidad. Unos estudios previos han mostrado que la membrana del basamento endotelial (EBM) controla aspectos de la adhesión, extensión, desplazamiento, contractilidad, diferenciación proliferación, síntesis de proteínas y secreción celular. Además de ello, la EBM es alterada en muchos estados de enfermedad in vivo desde diabetes hasta glorulopatía o aterosclerosis. La disfunción de células endoteliales se correlaciona con cambios en la composición de la membrana de basamento acumulando el grado de unión de células endoteliales y la calidad del anclaje de la membrana de basamento desempeña una función para la inmunobiología de las células endoteliales.

La presente invención está basada en el descubrimiento inesperado de que el anclaje y/o inclusión de células endoteliales en una matriz biocompatible adecuada como, pero sin limitación una matriz basada en colágeno tridimensional puede transformar células endoteliales xenogeneicas en un fenotipo de células inmunológicamente no agresivas. Este descubrimiento puede ser seguidamente explotado por el experto en la técnica siguiendo las indicaciones proporcionadas en la presente memoria descriptiva, como una aproximación inductora de tolerancia a terapias singeneicas o no singeneicas como, pero sin limitación, un alotrasplante o xenotrasplante, como se ilustra en la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, un facultativo puede disminuir y/o retrasar el rechazo implantando células endoteliales ancladas y/o incluidas en matrices antes del trasplante de un tejido u órgano de alo- o xeno-injerto. Para los fines de la presente invención, la sangre es un tipo de tejido.

El tratamiento previo aclimata el sistema inmune del receptor y puede dar lugar a una respuesta inmune atenuada y/o retrasada o reducida a un injerto. La presente invención no requiere que el material implantable comprenda células ancladas y/o incluidas que sean iguales o similares a las finalmente trasplantadas al receptor. Todo lo que se necesita es que el material implantable que comprende células ancladas y/o incluidas tenga un efecto inmunomodulador cuando es proporcionado a un receptor. En ciertas circunstancias, una administración única previa o coincidente con el trasplante puede ser suficiente. En otras circunstancias, se prefieren administraciones múltiples o en serie. El facultativo experto reconocerá estas circunstancias.

Como está bien reconocido, incluso el trasplante de células alogeneicas está acompañado a menudo de una respuesta inmune. Una cuestión de gran interés es si esto es una propiedad constitutiva e inmutable de células extrañas o que pueda ser regulada. Los experimentos expuestos en la presente memoria descriptiva demuestran que la inmunogenicidad de las células que están normalmente ancladas a membranas de basamento puede ser considerablemente reducida si se implantan en un estado anclado y/o incluido en una matriz y no se observa un efecto cuando estas mismas células son inyectadas en un estado libre. Otros experimentos expuestos en la presente memoria descriptiva investigan la influencia de la inmunidad de células anti-endoteliales destacadas, que es una característica clínica común en una diversidad de enfermedades autoinmunes y endocrinas.

Adicionalmente, algunos de los experimentos resumidos en la presente memoria descriptiva demuestran que las inyecciones en serie de células endoteliales aórticas porcinas (PAE) libres inducían anticuerpos anti-PAE en circulación, elevando la inmunosensibilidad. La respuesta a inyecciones de PEAD posteriores fue incluso mayor que la observada tras la primera exposición. Por el contrario, cuando las PAE fueron implantadas en un estado anclado y/o incluido en una matriz, la respuesta inmune a exposiciones posteriores se mutó y cayó significativamente a lo largo del tiempo. También, como se ilustra con posterioridad, inferior a la respuesta de IgG posterior y mutó cuando estuvo precedida por inyecciones en serie. La respuesta de IgM es más evidente en animales sin inmunizar que en los previamente sensibilizados y tarda más en disminuir después de una exposición a PAE libres que después de una exposición a células endoteliales ancladas y/o incluidas en matrices.

La sensibilización previa de ratones con suspensiones de PAE libre se parece a la inmunidad anti-endotelial accionada por IgG1 en la diabetes mellitus hipertensión y enfermedades autoinmunes. La respuesta inmune celular a células libres y ancladas y/o incluidas en matrices siguió el modelo de la inmunidad humoral. Una exposición repetida a antígenos dio lugar a una formación aumentada de memoria y posteriormente a una reacción inmune más vigorosa por células T efectoras. Por tanto, la inducción de esplenocitos productores de IL-4 y de IL-10 xeno-reactivos y células T efectoras aumentó a lo largo del tiempo y era visible después de una implantación de células endoteliales en ratones sin inmunizar y previamente sensibilizados. En todos los ratones, los niveles de citoquinas se correlacionaron de forma lineal y precisa con la inducción de células T efectoras, apoyando adicionalmente la noción de una respuesta celular accionada por t2 en la xeno-reactividad y acentuando los aspectos inmunosilenciadores de células endoteliales incluidas en matrices para activar mecanismos inmunes adaptivos. El deterioro de células endoteliales implantadas se correlacionó con el alcance de la respuesta inmune provocada. Las células implantadas estaban más profundamente afectadas después de la sensibilización previa y con PAE libre. La inducción disminuida de respuestas inmunes humorales y celulares en ratones sin inmunizar que recibieron células endoteliales incrustadas en matrices dio lugar a un grado menor de deterioro por células inmunes hospedantes.

Estos experimentos proporcionan indicios sobre la activación y el deterioro de células endoteliales, sugiriendo una función clave del contacto de la matriz celular. La estructura de tipo panal de abejas de una matriz actualmente preferida Gelfoam, permite que las células endoteliales se asocien, se anclen o se incluyan en su configuración tridimensional y, en ciertas realizaciones recubran las superficies internas de esta matriz de una forma que simula la apariencia del endotelio confluente en vasos estáticos. Por tanto, en ciertas realizaciones, el anclaje y/o inclusión de células endoteliales en una matriz con las propiedades de Gelfoam, se parece al estado tridimensional fisiológico del endotelio intacto. Los experimentos expuestos con posterioridad demuestran que el anclaje y/o inclusión en la matriz no solamente protege las células endoteliales de reacciones inmunes sino que cambia la perfección del hospedante de la inmunogenenicidad de células endoteliales.

Por tanto, durante la enfermedad, por ejemplo, la transformación fenotípica de células endoteliales dislocadas de un estado intacto adherente a la matriz hasta un estado libre probablemente es crítica para el inicio y la perpetuación de una enfermedad vascular, por ejemplo. Las explicaciones de la presente memoria descriptiva indican que el desprendimiento de células endoteliales precede la expresión de la adhesión, co-estimulación y las moléculas de MHC, lo que va seguido de una atracción de células inmunes, perpetuando la activación endotelial y el deterioro celular. A este respecto, las cuales inmunobiológicas e inmuno-reactivas de las células endoteliales se correlacionan con la morfología y la función. Las células endoteliales de diferentes lechos vasculares y la conectividad de membranas de basamentos divergentes demuestran diferencias marcadas en la expresión constitutiva e inducible de la adhesión, co-estimulación y moléculas de MHC. Adicionalmente, hay una apreciación creciente de que el depósito de proteínas de matrices extracelulares transicionales como fibronectina y fibrinógeno en la matriz subendotelial, así como el desprendimiento de células endoteliales de la membrana del basamento, afecta a la señalización de células intra-endoteliales.

La manipulación del fenotipo celular, la inmunogenicidad y la función se puede usar para adaptar las propiedades de constructos de ingeniería de tejidos desarrollados in vitro para fines regenerativos; en particular, este uso de la presente invención es clínicamente ventajoso ya que las terapias actuales basadas en células están limitadas por las profundas reacciones inmunes del hospedante. Por ejemplo, la presente invención es particularmente útil para el tratamiento de la enfermedad aterosclerótica, ya que la presencia de células inmunes activadas y de inflamación son componentes patofisiológicos claves. Análogamente, la inmunidad anti-endotelial destacada ha sido identificado como un efecto limitador de la velocidad esencial para terapias basadas en células endoteliales como, pero sin limitación, las terapias que incluyen la sembradura del interior de una estructura vascular con células o tejido. Por el contrario, la presente invención puede ser explotada para gestionar desplazamientos xenotípicos de células endoteliales que se producen en una patología vascular, por ejemplo, a través de la desagrupación del contacto con la matriz celular y se pueden realizar entonces opciones terapéuticas apropiadamente dirigidas a diana en el campo clínico usando materiales practicables de la presente invención.

Tomadas conjuntamente, las explicaciones presentadas en la presente memoria descriptiva demuestran también que las características de una matriz como, pero sin limitación, la biocompatibilidad, porosidad, carácter tridimensional, pueden apoyar el crecimiento de una población de células endoteliales y pueden modular la inmunogenicidad de estas células. Las células endoteliales ancladas y/o incluidas en una matriz tridimensional provocaron una activación mucho menor de los mecanismos inmunes del hospedante y estuvieron sometidas a un ataque y deterioro muy inferior de células inmunes hospedantes. Los descubrimientos en ratones sin inmunizar fueron amplificados en hospedantes con inmunidad anti-endotelial destacada. Los estudios in vivo presentados en la presente memoria descriptiva muestran una disminución considerable en la respuesta inmune activada por Th2 en animales implantados con una matriz como Gelfoam que comprendía células endoteliales ancladas y/o incluidas frente a animales inyectados con células endoteliales libres. Con el fin de que las células endoteliales activaran células T de hospedantes sin inmunizar, se requirieron dos señales: 1) presentación de antígenos en el contexto de moléculas DMHC expresadas en las células endoteliales del donante y 2) una segunda señal proporcionada por una molécula co-estimuladora expresada también en la superficie de las células endoteliales del donante. Por lo tanto, aunque no se desean vinculaciones teóricas, una posible explicación para los resultados observados es que la interacción entre una matriz biocompatible y las células endoteliales incluidas dio lugar a una disminución de la expresión superficial de moléculas MHC y/o de adhesión co-estimuladoras cruciales en las células endoteliales del donante. De hecho, un análisis in vitro de la expresión de moléculas de adhesión crítica, MHC-II y co-estimuladoras tanto en PAE como en HAE (células endoteliales aórticas humanas) muestra un perfil dependiente de células ancladas y/o incluidas en una matriz. Los perfiles de expresión de adhesión (E-selectina, P-selectina, ICAM-1, VCAM-1, y CD58) co-estimuladora (CD40, CD8, CD86) y moléculas MHC-II se redujeron todos en células endoteliales ancladas y/o incluidas con una matriz Gelfoam en comparación con las mismas células endoteliales hechas crecer en placas de cultivo de tejidos estándar. La P-selectina, E-selectina y UCAM-1 están estrechamente asociadas con el reclutamiento de células T en sitios inflamación inmune. Como la presentación de antígenos a células T CD4+ a través de moléculas de MHC clase II es esencial para el reconocimiento inmune del hospedante en el ajuste de implantes xenogeneicos no vascularizados, la expresión de MHC-II reducida observada en células endoteliales ancladas y/o incluidas en matrices se plasmó en una respuesta proliferativa reducida de esplenocitos del hospedante. Además de ello, la exposición in vitro repetida de los mismos esplenocitos a células endoteliales hechas crecer en placas de cultivo de tejidos provocó una respuesta secundaria más vigorosa, mientras que no hubo ninguna respuesta secundaria aumentada y, por lo tanto, ninguna memoria de exposición previa a células endoteliales ancladas y/o incluidas en matrices. Estos descubrimientos in vitro se correlacionan con la relación inmune significativamente mutada observada en ratas y ratones después de la implantación y nueva estimulación con células endoteliales ancladas y/o incluidas en matrices como se ilustra en la presente memoria descriptiva.

Análogamente, un mecanismo mediante el cual el cultivo de células endoteliales en una matriz biocompatible como, pero sin limitación Gelfoam, afecta a la expresión de moléculas de MHC clase II y la posterior inmunogenicidad endotelial posterior in vitro, fue adicionalmente dilucidado investigando las trayectorias de señalización intracelular. La expresión endotelial de moléculas MHC clase II es inducida por citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, interferón (IFN-?) que son secretadas por células inmunes activadas (por ejemplo, células T). La unión de citoquinas proinflamatorias a sus receptores en células endoteliales inicia una cascada de señalización intracelular que da lugar a la fosforilación de tirosina-quinasa de proteína de Jauns (por ejemplo JAK-1 y 2) y a transductores y activadores de señales de transcripción (por ejemplo, STAT-1). La activación de JAK y STAT habitualmente está estrictamente regulada en una célula diana. Como se expone con posterioridad unos análisis in vitro detallados demostraron diferencias en trayectorias de señalización intracelular inducidas por IFN-? entre células endoteliales hechas crecer para confluir en placas de cultivo de tejidos en comparación con las ancladas y/o incluidas en matrices Gelfoam. Las HAE incluidas en Gelfoam exhibieron velocidades inferiores de fosforilación y activación de STAT de factor 1 regulador de interferón (IRF-1) crucial, sin cambios en la expresión de receptor IFN? superficial. Las velocidades inferiores de activación de JAK se observaron también tras la estimulación de HAE en Gelfoam con IFN-?.

Tras una investigación adicional se observó que las HAE no estimuladas con IFN-? en una matriz Gelfoam expresaban niveles significativamente superiores de molécula inhibidora de acción contraria, supresor de señalización de citoquinas (SOCS) 1 y 3, que el crecimiento en placas de cultivos de tejidos. Por lo tanto, una explicación para la señalización intracelular inducida por IFN-? mutada es que los niveles aumentados de SOCS-1 y 3 dieron lugar a un aumento en el umbral de activación inducida por citoquinas de células endoteliales.

El material implantable de la presente invención puede ser implantado en un sitio no luminal. Por tanto, no es necesaria la exposición inmediata de células del donante a la circulación del hospedante. Una evidencian reciente ha demostrado la importancia del factor endotelial soluble CX3CL 1 (fractalquina) para la atracción de células inmunes (es decir, células asesinas naturales) y formas expresadas en la superficie de fractalquina para la adherencia de esas células inmunes. Dado que solamente se observó una infiltración celular leve en el interior y las proximidades de las células endoteliales ancladas y/o incluidas en matrices xeno- y alo-geneicas, se cuantificó la liberación de la expresión soluble y superficial de fractalquina en HAE. Como se ilustra en los experimentos expuestos a continuación, las células endoteliales ancladas y/o incluidas en matrices mostraron una secreción reducida y una regulación descendente de la expresión superficial de fractalquina tras la estimulación de citoquinas, en comparación con HAE hechas crecer en placas de cultivos de tejidos. Esto dio lugar a una adherencia significativamente menor de células asesinas naturales humanas a HAE ancladas y/o incluidas en matrices in vitro.

Tomados conjuntamente, los cambios en la señalización intracelular, niveles aumentados de SOCS-1 y 3 (que dan lugar a una expresión atenuada de moléculas MHC-II y posterior activación de células T) así como la secreción reducida y la expresión superficial de fractalquina en células endoteliales ancladas y/o incluidas en matrices en comparación con células hechas crecer en placas de cultivos de tejidos indicaron una inmunogenicidad de células endoteliales alterada atribuible a la inclusión en la matriz.

Fuente celular

Las células endoteliales, células de tipo endotelial o sus análogos para ser usadas según la presente invención pueden ser singeneicas, alogeneicas, xenogeneicas o autólogas. En ciertas realizaciones, una fuente de células vivas puede derivar de un donante adecuado. En otras ciertas realizaciones, una fuente de células puede derivar de un cadáver o de un banco de células.

En una realización actualmente preferida, las células son células endoteliales. En una realización particularmente preferida, estas células endoteliales son obtenidas a partir de tejido vascular, preferentemente, pero sin limitación tejido arterial. Como se ilustra con posterioridad, un tipo de célula endotelial vascular adecuado para ser usado es una célula endotelial aórtica. Otro tipo de célula endotelial vascular adecuada para ser usada está constituido por células endoteliales de venas del cordón umbilical. Otro tipo célula endotelial vascular adecuada para ser usada está constituida por las células endoteliales de arterias coronarias. Todavía, otros tipos de células endoteliales vasculares adecuadas para ser usadas en la presente invención incluyen células endoteliales de arterias pulmonares y células endoteliales de arteria ilíaca.

En otra realización actualmente preferida, las células endoteliales adecuadas pueden ser obtenidas a partir de tejido no vascular. El tejido no vascular puede derivar de cualquier estructura anatómica tubular como se describe en cualquier otro lugar en la presente memoria descriptiva o puede derivar de cualquier tejido u órgano no vascular.

Todavía, en otra realización, las células endoteliales pueden derivar de células progenitoras endoteliales o células madre; todavía, en otra realización, las células endoteliales pueden derivar de células progenitoras o células madre generalmente. En una realización preferida, las células pueden ser células progenitoras o células madre. En otras realizaciones preferidas, las células pueden ser células no endoteliales que sean singeneicas, alogeneicas, xenogeneicas o autólogas derivadas de un tejido u órgano vascular o no vascular. La presente invención contempla también cualquiera de los casos que anteceden que sean genéticamente alterados, modificados o tratados por ingeniería genética.

En una realización adicional, dos o más tipos de células son conjuntamente cultivados para preparar el presente material implantable. Por ejemplo, una primera célula puede ser introducida en la matriz biocompatible y cultivada hasta que se haga confluente. El primer tipo de célula puede incluir, por ejemplo, células de músculos lisos, fibroblastos, células madre, células progenitoras endoteliales, una combinación de células de músculos lisos y fibroblastos, cualquier otro tipo de célula deseada o una combinación de los tipos de células deseadas adecuadas para crear un entorno conductor para el crecimiento de células endoteliales. Una vez que el tipo de célula ha alcanzado la confluencia, es sembrado un segundo tipo de célula en la parte superior del primer tipo de célula confluente en el interior, por encima o con la matriz biocompatible y es cultivado hasta que el primer tipo de célula y el segundo tipo de célula hayan alcanzado la confluencia. El segundo tipo de célula puede incluir, por ejemplo, células endoteliales o cualquier otro tipo deseado de células o combinaciones de tipos de células. Está contemplado que el primero y segundo tipos de células puedan ser introducidos por etapas, o como una única mezcla. Está también contemplado que la densidad celular pueda ser modificada para alterar la relación de células de músculos lisos a células endoteliales. Análogamente, pueden ser sembradas matrices con una mezcla de diferentes células adecuadas para la indicación o régimen clínico previsto.

Las células endoteliales ancladas y/o incluidas células de tipo endotelial o sus análogos exhiben uno o más fenotipos o propiedades funcionales deseados. La presente invención se basa en el descubrimiento de que una célula que tiene un fenotipo fácilmente identificable (descrito en otro lugar en la presente memoria descriptiva) cuando se asocia con una matriz preferida puede reducir, mejorar y/o modular de algún otro modo una respuesta inmune o reacción inflamatoria a través efectos sistémicos y/o locales.

Para los fines de la presente invención, uno de estos fenotipos preferidos fácilmente identificables típico de las células de la presente invención es un fenotipo inmunogénico alterado medido mediante los ensayos in vitro descritos en otro lugar en la presente memoria descriptiva. Otro fenotipo fácilmente identificable típico de las células de la presente invención es una capacidad para bloquear o interferir con la maduración de células dendríticas según se mide mediante los ensayos in vitro descritos en otro lugar en la presente memoria descriptiva. Cada fenotipo es denominado en la presente memoria descriptiva un fenotipo inmunomodulador.

Evaluación de la funcionalidad inmunomoduladora

Para los fines de la invención descritos en la presente memoria descriptiva, el material implantable puede ser ensayado en cuanto a indicios de la funcionalidad inmunorreguladora antes del implante. Por ejemplo, son evaluadas muestras del material implantable para determinar su capacidad para reducir la expresión de moléculas MHC clase II, para reducir la expresión de moléculas co-estimuladoras, para inhibir la maduración de células dendríticas conjuntamente cultivadas y para reducir la proliferación de células T. En ciertas realizaciones preferidas, el material implantable puede ser usado para los fines descritos en la presente memoria descriptiva cuando el material es capaz de reducir la expresión de moléculas MHC clase II en al menos aproximadamente 25-80%, preferentemente 50-80%, lo más preferentemente al menos aproximadamente 80%, para reducir la expresión de moléculas co-estimuladoras en al menos aproximadamente 25-80%, preferentemente 50-80%, lo más preferentemente al menos aproximadamente 80%; inhibir la maduración de células dendríticas conjuntamente cultivadas en al menos aproximadamente 25-95%, preferentemente 50-95%, lo más preferentemente al menos aproximadamente 95%; y/0 reducir la proliferación de linfocitos en al menos aproximadamente 25-90%, preferentemente 50-90%, lo más preferentemente al menos aproximadamente 90%.

Los niveles de expresión de moléculas DMHC clase II y moléculas co-estimuladoras puede ser cuantificados usando análisis de citometría de flujo rutinarios, descritos en detalle con posterioridad. La proliferación de linfocitos puede ser cuantificada in vitro cultivando conjuntamente linfocitos CD3+ marcados con 3[H]-timidina con la composición implantable a través de recuento por centelleo como se describe en detalle con posterioridad. La inhibición de la maduración de células dendríticas puede ser cuantificada cultivando conjuntamente el material implantable con células dendríticas y evaluando la expresión superficial de diversos marcadores en las células dendríticas mediante citometría de flujo y análisis FACS, o midiendo la absorción de células dendríticas de dextrano conjugado a FITC mediante citometría de flujo. Cada uno de estos métodos se describe en detalle con posterioridad.

En una realización operativa típica de la presente invención, las células solo necesitan exhibir uno de los fenotipos que anteceden. En ciertas realizaciones, las células pueden exhibir más de uno de los fenotipos que anteceden.

Aunque los fenotipos que anteceden tipifican cada uno una célula endotelial funcional como, pero sin limitación una célula endotelial vascular, una célula no endotelial que exhiba este (o estos) fenotipo(s) es considerada de tipo endotelial para los fines de la presente invención y, por tanto, es adecuada para ser usada con la presente invención. Las células que son de tipo endotelial se denominan también, en la presente memoria descriptiva, análogos funcionales de células endoteliales; o emuladores funcionales de células endoteliales. Por tanto, a modo de ejemplo solamente, las células adecuadas para ser usadas con los materiales y métodos descritos en la presente memoria descriptiva incluyen también células madre o células progenitoras que dan lugar a células de tipo endotelial; las células que son células no endoteliales en origen sin embargo rinden con una funcionalidad como una célula endotelial usando los parámetros expuestos en la presente memoria descriptiva; las células de cualquier origen que son tratadas por ingeniería genética o modificadas de algún otro modo para tener una funcionalidad endotelial usando los parámetros expuestos en la presente memoria descriptiva.

Normalmente, las células de la presente invención exhiben uno o más de los fenotipos anteriormente mencionados cuando presentan poblaciones confluentes, casi confluentes o confluentes con posterioridad y están asociadas con una matriz biocompatible preferida como las descritas en otro lugar en la presente memoria descriptiva. Como se apreciará por un experto en la técnica, las poblaciones de células confluentes, casi confluentes o confluentes con posterioridad son fácilmente identificables mediante una diversidad de técnicas, de las que las más comunes y ampliamente aceptadas están constituidas por el examen microscópico directo. Otras incluyen la evaluación del número de células por área superficial usando técnicas de recuento de células estándar como, pero sin limitación, un hemocitómetro o contador Coulter.

Adicionalmente, para los fines de la presente invención, las células de tipo endotelial incluyen, pero sin limitación células que emulan e imitan células endoteliales funcional y fenotípicamente confluentes, casi confluentes o confluentes con posterioridad, según se mide mediante los parámetros expuestos en la presente memoria descriptiva.

Por tanto, usando la descripción y las indicaciones detalladas expuestas con posterioridad, el usuario de los conocimientos de la técnica apreciará el modo de preparar, usar, ensayar e identificar realizaciones operativas del material implantable descrito en la presente memoria descriptiva. Es decir, las explicaciones proporcionadas en la presente memoria descriptiva exponen todo lo necesario para preparar y usar los materiales implantables de la presente invención.

En ciertas realizaciones preferidas, las células endoteliales usadas en el material implantable de la presente invención son aisladas de los donantes de aortas o cadáveres humanos. Cada lote de células deriva de un único o de múltiples donantes, ensayados extensivamente en cuanto a la pureza de células endoteliales, función biológica, la presencia de bacterias, hongos, elementos patógenos humanos conocidos y otros agentes perjudiciales. Las células son crioconservadas y almacenadas en bancos usando técnicas bien conocidas para las posterior expresión en cultivos y para una posterior formulación en materiales implantables biocompatibles. En otras realizaciones, pueden ser recolectadas células vivas a partir de un donante o a partir del paciente para el que está previsto el material implantable.

Preparación de células

Como se estableció anteriormente, las células adecuadas pueden ser obtenidas a partir de una diversidad de tipos de tejidos y tipos de células. En ciertas realizaciones preferidas, las células endoteliales aórticas humanas usadas en el material implantable son aisladas a partir de la aorta de donantes cadáveres. En otras realizaciones, son aisladas células endoteliales aórticas porcinas (Cell Applications, San Diego, CA) a partir de aorta porcina normal mediante un procedimiento similar al usado para aislar células endoteliales aórticas humanas. Cada lote de células deriva de un único o de múltiples donantes, son ensayadas extensivamente en cuanto a la viabilidad de células endoteliales, pureza, función biológica, la presencia de micoplasma, bacterias, hongos, levaduras, elementos patógenos humanos conocidos y otros agentes perjudiciales. Las células son adicionalmente expandidas, caracterizadas y crioconservadas para formar un banco de células de trabajo en la tercera a sexta pasada usando técnicas bien conocidas para un expansión en cultivo posterior y para la subsecuente formulación en forma de un material implantable biocompatible.

Lo que sigue es un protocolo ilustrativo para preparar células endoteliales adecuadas para ser usadas con la presente invención. Las células endoteliales aórticas humanas o porcinas se preparan en matraces T-75 previamente tratados mediante la adición de aproximadamente 15 ml de medios de crecimiento de células endoteliales por matraz. Las células endoteliales aórticas humanas se preparan en medios de crecimiento endoteliales (EGM-2, Cambrex Biosciences, East Rutherford, NJ). El EGM-2 consiste en medios basales de células endoteliales (EBM-2, Cambrex Biosciences) complementados con EGM-2 que contiene FBS al 2%. Las células porcinas se preparan en EBM-2 complementado con FBS al 5% y 50 µg/ml de gentamicina. Los matraces se colocan en un incubador mantenido a aproximadamente 37ºC y 5% CO2/95% aire, 90% de humedad durante un mínimo de 30 minutos. Uno o dos viales de las células son retirado del congelador a -160ºC -140ºC y descongelados a aproximadamente 37ºC. Cada vial de células descongeladas es sembrado en dos matraces T-75 a una densidad de aproximadamente 3 x 103 células por cm3, preferentemente, pero no menos de 1,0 x 103 y no más de 7,0 x 103; y los matraces que contiene las células son devueltos al incubador. Después de aproximadamente 8-24 horas, los medios agotados se retiran y se restituyen con medios de nueva aportación. Los medios se cambian cada dos a tres días y, posteriormente, hasta que las células alcanzan aproximadamente 85-100% de confluencia, preferentemente pero no menos de 60% y no más de 100%. Cuando el material implantable está destinado a una aplicación clínica, solamente se usan medios exentos de antibióticos en el cultivo posterior a la descongelación de células endoteliales aórticas humanas y la fabricación del material implantable de la presente invención.

Los medios de crecimiento de células endoteliales son seguidamente retirados y la monocapa de células se aclara con 10 ml de solución salina tamponada HEPES (HEPES). El HEPES es retirado y se añaden 2 ml de tripsina para desprender las células de la superficie del matraz T-75. Una vez que se ha producido el desprendimiento se añaden 3 ml de solución neutralizante de tripsina (TNS) para detener la reacción enzimática. Se añaden 5 ml adicionales de HEPES y las células son enumeradas usando un hemocitómetro. La suspensión celular se centrifuga y se ajusta, en el caso de células humanas, a una densidad de aproximadamente 1,75 x 106 células/ml usando EGM-2 sin antibióticos o, en el caso de células porcinas, aproximadamente 1,50 x 106 células/ml usando EBM-2 complementado con FBS al 5% y 50 µg/ml de gentamicina.

Matriz biocompatible

Según la presente invención, el material implantable comprende una matriz biocompatible que tiene una configuración tridimensional de forma que las células ancladas y/o incluidas pueden crear y ocupar un hábitat multi-dimensional. La matriz permite el crecimiento celular y el anclaje y/o inclusión de células en la matriz. Son preferidas las matrices porosas. La matriz puede ser sólida o no sólida. Algunas matrices no sólidas son fluidas y adecuadas para una administración a través de métodos de tipo inyección o de tipo infusión. En ciertas realizaciones, la matriz es flexible y cómoda. La matriz puede estar también en la forma de una forma plana flexible. La matriz puede estar también en la forma de un gel, una espuma, una suspensión, una partícula, un microportador, una microcápsula o una estructura fibrosa. En ciertas realizaciones preferidas, las formas no sólidas de la matriz a la que están ancladas las células y/o en las que son incluidas las células, puede ser inyectada o aplicada por infusión cuando es administrada.

Una matriz actualmente preferida es Gelfoam® (Pfizer, New York, NY) y una esponja de gelatina absorbible (en lo sucesivo "matriz Gelfoam"). La matriz Gelfoam es una matriz de tipo esponja porosa y flexible preparada a partir de solución de gelatina dérmica porcina especialmente tratada y purificada.

Según otra realización, el material de la matriz biocompatible puede ser un material de matriz modificado. Las modificaciones para el material de la matriz se pueden seleccionar para optimizar y/o para controlar la función de las células, incluido el fenotipo de las células (por ejemplo el fenotipo inmunomodulador), como se describe en otro lugar en la presente memoria descriptiva, cuando las células están asociadas con la matriz. Según una realización, las modificaciones para el material de la matriz incluyen revestir la matriz con factores de enlace o péptidos de adhesión. Ejemplos de factores de enlace incluyen, por ejemplo, fibronectina, gel de fibrina y ligandos de adhesión celular covalentemente unidos (que incluyen, por ejemplo, RGD) que utilizan una química de carbodiimidas acuosas estándar. Los ligandos de adhesión celular adicionales incluyen péptidos que tienen secuencias de reconocimiento de la adhesión celular que incluyen, pero sin limitación: RGDY, REDVY, GRGDF, GPDSGR, GRGDY y REDV.

Según otra realización, la matriz es una matriz distinta de Gelfoam. Ejemplos adicionales de materiales de matrices incluyen, por ejemplo, gel de fibrina, alginato, microportadores de poliestireno-sulfonato de sodio, microportadores de dextrano revestido con colágeno, celulosa, PLA/PGA y copolímeros de pHEMA/MMA (con relaciones de polímeros que varían en el intervalo de 1-100% para cada polímero). Según una realización preferida, estas matrices adicionales son modificadas para incluir factores de enlace, como se mencionó y se describió anteriormente.

Según otra realización, el material de la matriz biocompatible es físicamente modificado para mejorar la unión celular a la matriz. Según una realización, la matriz es reticulada para aumentar sus propiedades mecánicas y para mejorar su unión celular y sus propiedades de crecimiento. Según una realización preferida, una matriz de alginato es reticulada en primer lugar usando sulfato de calcio seguido de una segunda etapa de reticulación usando cloruro de calcio y protocolos rutinarios.

Todavía, según otra realización, es modificado el tamaño de poros de la matriz biocompatible. Un tamaño de poros de la matriz actualmente preferido es de aproximadamente 25 µm a aproximadamente 100 µm; preferentemente de aproximadamente 25 µm a 50 µm; más preferentemente de aproximadamente 50 µm a 75 µm; incluso más preferentemente de aproximadamente 75 µm a 100 µm. Otros tamaños de poros preferidos incluyen tamaños de poros por debajo de aproximadamente 25 µm y por encima de aproximadamente 100 µm. Según una realización, el tamaño de poros es modificado usando una técnica de lixiviación de sales. Se mezcla cloruro de sodio en una solución del material de la matriz y un disolvente, la solución se vierte en un molde y el disolvente se deja evaporar. El bloque de matriz/sal es seguidamente sumergido en agua y la sal es separada por lixiviación, dejando una estructura porosa. El disolvente es escogido con el fin de que la matriz esté en solución, pero la sal no lo esté. Un ejemplo de solución incluye PLA y cloruro de metileno.

Según una realización alternativa, son incorporadas burbujas de dióxido de carbono gaseoso en una forma no sólida de la matriz y seguidamente son estabilizadas en un tensioactivo apropiado. Las burbujas gaseosas son posteriormente retiradas aplicando un vacío, dejando un estructura porosa.

Según otra realización, se emplea una técnica de liofilización para controlar el tamaño de poros de la matriz, usando la velocidad de congelación de las micropartículas de hielo para formar poros de tamaños diferentes. Por ejemplo, una solución en gelatina de aproximadamente 0,1-2% de gelatina porcina o bovina puede ser vertida en un molde o un plato y previamente congelada a una diversidad de temperaturas diferentes y seguidamente liofilizada durante un período de tiempo. El material puede ser seguidamente reticulado usando, preferentemente, luz ultravioleta (254 nm) o añadiendo glutaraldehído (formaldehido). Las variaciones en la temperatura previa de congelación (por ejemplo, -20ºC, -80ºC o -180ºC), temperatura de liofilización (congelación en seco a aproximadamente -50ºC) y concentración de gelatina (0,1% a 2,0%; el tamaño de poros generalmente es inversamente proporcional a la concentración de gelatina en la solución) pueden afectar al tamaño de poros resultantes del material de la matriz y pueden ser modificadas para crear un material preferido. El experto en la técnica apreciará que un tamaño de poros adecuados es el que favorezca y mantenga poblaciones celulares óptimas que tengan los fenotipos descritos en otros lugares en la presente memoria descriptiva.

Sembradura celular de la matriz biocompatible

Lo que sigue es una descripción de un ejemplo de configuración de una matriz biocompatible. Como se establece en otros lugares, las matrices preferidas son sólidas o no sólidas y pueden ser formuladas para implantación, inyección o infusión.

Trozos previamente cortados de una matriz biocompatible adecuada o una parte alícuota de matriz fluida biocompatible adecuada son nuevamente hidratados mediante la adición de EGM-2 sin antibióticos a aproximadamente 37ºC y 5% de CO2/95% de aire durante 12 a 24 horas. El material implantable es seguidamente retirado de sus recipientes de nueva hidratación y se coloca en platos de cultivo de tejidos individuales. La matriz biocompatible es sembrada a una densidad preferida de aproximadamente 1,5-2,0 x 105 células (1,25-1,66 x 105 células/cm3 de matriz) y se coloca en un incubador mantenido a aproximadamente 37ºC y 5% de CO2/95% de aire, 90% de humedad durante 3-4 horas para facilitar la unión de células. La matriz sembrada se coloca seguidamente en tubos recipientes individuales (Evergreen, Los Angeles, CA) cada uno de ellos provisto con una tapadera que contiene un filtro de 0,2 µm con EGM-2 y se incubó a aproximadamente 37ºC y 5% de CO2/95% de aire. Los medios se cambian cada dos a tres días, posteriormente, hasta que las células hayan alcanzado la confluencia. Las células en una realización preferida tienen preferentemente 6 pasadas, pero pueden ser usadas células de menos o más pasadas.

Crecimiento celular

Una muestra de material implantable es retirada aproximadamente los días 3 ó 4, 6 ó 7, 9 ó 10 y 12 ó 13, las células son sometidas a recuento y ensayadas en cuanto a viabilidad, y se elabora una curva de crecimiento que se evalúa con el fin de valorar las características de crecimiento y determinar si se ha conseguido la confluencia, casi la confluencia o la confluencia posterior. Generalmente, un experto en la técnica apreciará los indicios de un crecimiento celular aceptable en valores de tiempo tempranos, medios y tardíos, como mediante la observación de un aumento exponencial en el número de células en valores de tiempo tempranos (por ejemplo, entre aproximadamente 2-6 días usando células endoteliales aórticas porcinas), seguido de una fase casi confluente (por ejemplo, entre aproximadamente 6-8 días), seguida de una plataforma en el número de células una vez que las células han alcanzado la confluencia (por ejemplo, entre aproximadamente 8-10 días) y mantenimiento del número de células cuando las células son confluentes con posterioridad (por ejemplo, entre aproximadamente 10-14 días).

Los recuentos celulares se consiguen mediante la digestión completa de la parte alícuota de material implantable con una solución de 0,5 mg/ml de colagenasa en solución de HEPES/Ca++. Después de medir el volumen del material implantable digerido, se diluye un volumen conocido de la suspensión celular con 0,4% de azul de trípano (4:1 células a azul de trípano) y la viabilidad se valora mediante exclusión de azul de trípano. Las células viables, no viables y totales se enumeran usando un hemocitómetro. Se elaboran curvas de crecimiento representando gráficamente el número de células viables frente al número de días en cultivo.

Para los fines de la presente invención, la confluencia se define como la presencia de al menos aproximadamente 4 x 105 células/cm3 cuando está en un ejemplo de forma plana flexible del material implantable (1,0 x 4,0 x 0,3 cm) y preferentemente de aproximadamente 7 x 105 a 1 x 106 células totales por parte alícuota (50-70 mg) cuando está en una composición inyectable o aplicable por infusión. Para ambos casos, la viabilidad celular es de al menos 90%, preferentemente, pero no menor que 80%.

En una realización actualmente preferida, el material implantable está en una forma plana flexible y comprende células endoteliales, preferentemente células endoteliales vasculares como, pero sin limitación células endoteliales aórticas humanas y la matriz biocompatible de esponja de gelatina Gelfoam® (Pfizer, New York, NY, en lo sucesivo "matriz Gelfoam").

El material implantable de la presente invención comprende células ancladas y/o incluidas en una matriz biocompatible que tiene una configuración tridimensional, de forma que las células ancladas y/o incluidas pueden crear y ocupar un hábitat multi-dimensional. Anclado y/o incluido con medios significa unidos de forma segura a través de interacciones de célula a célula y/o de célula a matriz de forma que las células resistan los rigores de las manipulaciones preparatorias descritas en la presente memoria descriptiva. Como se explica en otro lugar en la presente memoria descriptiva, una realización operativa del material implantable comprende una población celular casi confluente, confluente o posteriormente confluente que tenga un fenotipo preferido. Debe entenderse que las realizaciones del material implantable albergan células durante las manipulaciones preparatorias y/o que ciertas células no están unidas de forma segura como lo están otras células.

El material implantable de la presente invención fue desarrollado sobre los principios de la ingeniería de tejidos y representa una nueva aproximación para abordar las necesidades clínicas descritas en la presente memoria descriptiva. El material implantable de la presente invención es único en cuanto que las células viables ancladas y/o incluidas en la matriz biocompatible son capaces de suministrar al sitio de administración múltiples productos basados en células en proporciones fisiológicas bajo un control de retroalimentación fisiológica. El suministro local de múltiples compuestos por estas células y la dosificación fisiológicamente dinámica proporcionan una regulación más eficaz de los procedimientos responsables de modular una respuesta inmune. El material implantable de la presente invención puede proporcionar un entorno que emule una fisiología de soporte y conduzca a la modulación de una respuesta inmune.

Evaluación de la funcionalidad

Para los fines de la invención descritos en la presente memoria descriptiva, el material implantable es ensayado en cuanto a indicios de funcionalidad antes del suministro a un receptor. Por ejemplo, como una determinación del carácter adecuado, se recogen medios acondicionados durante el período de cultivo para determinar los niveles de sulfato de heparano o factor de crecimiento transformante ß1 (TGF- ß1) o factor de crecimiento de fibroblastos básico (b-FGF) o de óxido nítrico, que son producidos por las células endoteliales cultivadas. En ciertas realizaciones preferidas, el material implantable puede ser usado para los fines descritos en la presente memoria descriptiva cuando el número de células total es de al menos aproximadamente 1, preferentemente de aproximadamente 2, más preferentemente al menos aproximadamente 4 x 105 células/cm3 de forma plana flexible; el porcentaje de células viables es de al menos aproximadamente 80-90%, preferentemente ~ 90%, lo más preferentemente al menos 90%; el sulfato de heparano en los medios acondicionados es de al menos aproximadamente 0,1-0,5, preferentemente al menos aproximadamente 0,23 microgramos/ml/día. Si se desean otros indicios, entonces el TGF-ß1 en medios acondicionados es de al menos aproximadamente 200-300, preferentemente al menos aproximadamente 300 picogramos/ml/día; el b-FGF en medios acondicionados está por debajo de aproximadamente picogramos/ml, preferentemente es de no más de aproximadamente 400 picogramos/ml.

Los niveles de sulfato de heparano pueden ser cuantificados usando un ensayo espectrofotométrico de digestión ABC de azul de dimetilmetileno-condroitinasa. Los niveles totales de glicosaminoglicano (GAG) sulfatado se determinan usando un ensayo de unión de colorante de azul de dimetilmetileno (DMB) en el que las muestras desconocidas son comparadas con una curva estándar generada usando cantidades conocidas de sulfato de condroitina purificado en medios de recogida. Se mezclan muestras adicionales de medio acondicionado con condroitinasa-ABC para digerir condroitina y sulfatos de dermatano antes de la adición del reactivo colorante de DMB. Todas las absorbancias son determinadas a la absorbancia de longitud de onda máxima del colorante DMB mezclado con patrón de GAG, generalmente aproximadamente a 515-525 nm. La concentración de sulfato de heparano por día se calcula restando la concentración de condroitina y sulfato de dermatano de la concentración total de glicosaminoglicano sulfatado en muestras de medios acondicionadas. La actividad de condroitinasa-ABC es confirmada mediante digestión de una muestra de sulfato de condroitina purificado. Las muestras de medios acondicionados son corregidas apropiadamente si se digiere menos de 100% de sulfato de condroitina purificado. Los niveles de sulfato de heparano pueden ser cuantificados también usando un ensayo ELISA empleando anticuerpos monoclonales.

Si se desea, los niveles de TGF-ß1 y b-FGF pueden ser cuantificados usando un ensayo ELISA que emplea anticuerpos monoclonales o policlonales, preferentemente policlonales. Los medios de recogida testigos pueden ser cuantificados también usando un ensayo ELISA y las muestras pueden ser corregidas apropiadamente para los niveles de TGF-ß1 y b-FGF presentes en medios testigos. Los niveles de óxido nítrico (NO) pueden ser cuantificados usando un ensayo de reacción de Griess. La naturaleza transitoria y volátil del óxido nítrico la hace inadecuado para la mayoría de los métodos de detección. Sin embargo, dos productos de descomposición estables del óxido nítrico, el nitrato (NO3) y el nitrito NO2) pueden ser detectados usando métodos fotométricos rutinarios. El ensayo de la reacción Griess convierte enzimáticamente nitrato en nitrito en presencia de nitrato reductasa. El nitrito es detectado por colorimetría en forma de un producto colorante azoico coloreado, absorbiendo luz visible en el intervalo de aproximadamente 540 nm. El nivel de óxido nítrico presente en el sistema se determina convirtiendo todo el nitrato en nitrito, determinando la concentración total de nitrito en las muestras desconocidas y comparando seguidamente la concentración resultante de nitrito de una curva estándar generada usando cantidades conocidas de nitrato convertido en nitrito.

También, puede ser usado uno cualquiera o más de los ensayos que anteceden solos o en combinación como un ensayo de selección para identificar una célula que sea adecuada para ser usada con el material implantable de la presente invención.

Aunque el fenotipo inmunomodulador preferido descrito con anterioridad puede ser valorado usando uno o más de los ensayos funcionales cuantitativos opcionales de sulfato de heparina, TGF-ß1, NO y/o b-FGF, el material implantable puede ser evaluado en cuanto a la presencia de uno o más fenotipos inmunomoduladores preferidos como sigue. Para los fines de la presente invención, uno de estos fenotipos fácilmente identificables típicos de las células de la presente invención es un fenotipo inmunogénico alterado medido mediante los ensayos in vitro descritos con posterioridad. Otro fenotipo fácilmente identificable típico de las células de la presente

Reivindicaciones:

1. Un material implantable, que comprende una matriz biocompatible y células endoteliales ancladas o incluidas, células de tipo endotelial o sus análogos para ser usado en la reducción de una respuesta inmune o una reacción inflamatoria en un método que comprende la etapa de proporcionar dicho material implantable a un receptor en una cantidad suficiente para reducir la respuesta inmune o la reacción inflamatoria en dicho receptor, en que la matriz tiene una configuración tridimensional de forma que las células ancladas y/o incluidas pueden crear y ocupar un hábitat multi-dimensional.

2. El material de la reivindicación 1, en el que la etapa de provisión es anterior, coincidente o posterior a la administración a dicho receptor de una o más dosis de una célula, tejido u órgano de un donante singeneico o no singeneico.

3. El material de la reivindicación 1, en el que la etapa de provisión es anterior, coincidente o posterior a la existencia de la respuesta inmune o reacción inflamatoria.

4. Un material implantable, que comprende una matriz biocompatible y células endoteliales, células de tipo endotelial o sus análogos ancladas o incluidas para ser usado en la inducción de aceptación o tolerancia en un paciente en un método que comprende la etapa de proporcionar dicho material implantable de forma anterior, coincidente o posterior al trasplante de células, tejidos u órganos de de autoinjertos, xenoinjertos o aloinjertos, en dicho paciente en una cantidad eficaz para inducir aceptación o tolerancia en dicho paciente, en que la matriz tiene una configuración tridimensional de forma que las células ancladas y/o incluidas pueden crear y ocupar un hábitat multi-dimensional.

5. El material de la reivindicación 4, en el que las células, tejidos u órganos del autoinjerto, xenoinjerto o aloinjerto comprenden células no endoteliales.

6. Un material implantable, que comprende una matriz biocompatible y células endoteliales, células de tipo endotelial o sus análogos ancladas o incluidas, para ser usado en la reducción de la inmunogenicidad de antígenos del donante en un método que comprende la etapa de proporcionar dicho material implantable de forma anterior, coincidente o posterior a la introducción de dicho antígeno del donante en un receptor en una cantidad eficaz para reducir la inmunogenicidad de antígenos del donante, en que la matriz tiene una configuración tridimensional de forma que las células ancladas y/o incluidas pueden crear y ocupar un hábitat multidimensional.

7. El material de la reivindicación 6, en el que la inmunogenicidad de los antígenos del donante es una inmunogenicidad de antígenos de células del donante no endoteliales.

8. El material de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en el dicho donante y receptor son el mismo.

9. Un material implantable, que comprende una matriz biocompatible y células endoteliales ancladas o incluidas, células de tipo endotelial o sus análogos para ser usado en un método para trasplantar a un receptor un trasplante de células, tejidos u órganos singeneicos o no sigeneicos de forma anterior, coincidente o posterior al trasplante, de forma que dicha célula, tejido u órgano singeneico o no singeneico trasplantado no sea rechazado por dicho receptor, en el que la matriz tiene una configuración tridimensional de forma que las células ancladas y/o incluidas pueden crear y ocupar un hábitat multi-dimensio- nal.

10. El material de la reivindicación 9, que comprende células no endoteliales.

11. Un material implantable, que comprende una matriz biocompatible y células endoteliales, células de tipo endotelial o sus análogos ancladas o incluidas, para ser usado en la reducción de una respuesta inmune o una reacción inflamatoria que resulta de la exposición a un inmunógeno exógeno en un método que comprende la etapa de proporcionar dicho material implantable a un receptor en una cantidad suficiente para reducir la respuesta inmune o la reacción inflamatoria en dicho receptor que resulta de la exposición a dicho inmunógeno exógeno, en que la matriz tiene una configuración tridimensional de forma que las células ancladas y/o incluidas pueden crear y ocupar un hábitat multi-dimensional.

12. El material de la reivindicación 1, reivindicación 4 o reivindicación 6, en que dicha etapa de provisión se produce de forma anterior, coincidente o posterior a la administración a dicho paciente de un agente inmunosupresor.

13. El material de la reivindicación 12, en el que dicho agente inmunosupresor reside en dicho material implantable durante la administración coincidente.

14. El material de la reivindicación 9, en el que el método comprende adicionalmente la etapa de administrar un agente inmunosupresor de forma anterior, coincidente o posterior al trasplante.

15. El material para ser usado de la reivindicación 1, reivindicación 4 o reivindicación 6, en que dicho receptor tiene una enfermedad autoinmune.

16. Un material implantable, para ser usado en un método para reducir una respuesta inmune a una célula, tejido u órgano no singeneico, en que dicho material implantable comprende una matriz biocompatible y ancladas o incluidas al mismo, células endoteliales, células de tipo endotelial o sus análogos, en que una cantidad eficaz de dicho material implantable reduce la respuesta inmune del receptor a dicha célula, tejido u órgano no singeneico y en que la matriz tiene una configuración tridimensional de forma que las células ancladas y/o incluidas pueden crear y ocupar un hábitat multi-dimensional.

17. El material de la reivindicación 16, en el que dicha célula, tejido u órgano no singeneico es el del receptor que padece una enfermedad autoinmune.

18. El material de la reivindicación 11, en el que la etapa de provisión es anterior, coincidente o posterior a la existencia de la respuesta inmune o reacción inflamatoria.

19. El material de la reivindicación 11, en el que dicho inmunógeno exógeno se produce de forma natural.

20. El material de la reivindicación 11, en el que dicho inmunógeno exógeno se selecciona entre el grupo que consiste en agentes farmacéuticos, toxinas, implantes quirúrgicos, agentes infecciosos y productos químicos.

21. El material de la reivindicación 11, en el que dicho inmunógeno exógeno es un estímulo exógeno seleccionado entre el grupo que consiste en estrés medioambiental, lesión y exposición.

22. El material de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células endoteliales, células de tipo endotelial o análogos de las mismas (a) son células no endoteliales o (b) son análogos no naturales.

23. El material de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que las células endoteliales, células de tipo endotelial o sus análogos, cuando están anclados o incluidos en una matriz biocompatible, reducen una respuesta inmune humoral o celular del receptor respecto a una célula, tejido u órgano de un donante no singeneico.

24. El material de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que las células endoteliales, células de tipo endotelial o sus análogos, cuando están ancladas o incluidas en una matriz biocompatible exhiben una inmunogenicidad disminuida.

25. El material la reivindicación 24, en el que dicha inmunogenicidad disminuida es una expresión reducida de MHC o una capacidad reducida de unirse, activar o favorecer la maduración de células inmunes innatas, cuando están ancladas o incluidas en una matriz biocompatible, en que dichas células inmunes innatas se seleccionan entre el grupo que consiste en células NK, células dendríticas, monocitos y macrófagos.

26. El material de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que las células endoteliales, células de tipo endotelial o sus análogos, cuando están ancladas incluidas en una matriz biocompatible, exhiben una expresión reducida de MHC, moléculas co-estimuladoras o moléculas de adhesión.

27. El material de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que las células endoteliales, células de tipo endotelial o sus análogos, cuando están ancladas o incluidas en una matriz biocompatible y son conjuntamente cultivados con una célula dendrítica, inhiben la expresión mediante dicha célula dendrítica de HLA-DR, IL12, receptor de tipo Toll o CD83, favorecen la absorción de dextrano por dichas célula dendrítica o bloquean la proliferación de linfocitos inducidos por células dendríticas.

28. El material de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que las células endoteliales, células de tipo endotelial o sus análogos, cuando son conjuntamente cultivadas con células inmunes adaptativas, inhiben la proliferación, activación o diferenciación de dichas células, en que dichas células inmunes adaptativas se seleccionan entre el grupo que consiste en linfocitos B y linfocitos T.


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