Kits para la recolección de sangre, preferentemente sangre periférica, para la producción de células madre.

Kit para la recolección de sangre, preferentemente sangre periférica,

para la producción de células madrepluripotenciales, que comprende al menos un primer recipiente (12) capaz de contener la sangre extraída, quecontiene un anticoagulante y la sustancia MCSF (factor estimulante de las colonias de macrófago) y al menos unsegundo recipiente (18, 20) fabricado con al menos la pared interna de un material que previene la adhesión de lascélulas madre.

Kits para la recolección de sangre, preferentemente sangre periférica, para la producción de células madre Campo de la invención La presente invención se refiere a un kit parala recolección de sangre, preferentemente de tipo periférico, para la producción de células madre adultas.

Antecedentes de la invención En los últimos años, el uso de células madre en terapia ha tenido una amplia aprobación debido a los éxitos obtenidos en el tratamiento de enfermedades que hasta ahora se consideraban incurables.

No obstante, los procedimientos conocidos para obtener células madre son largos, laboriosos y costosos.

Las células madre pluripotenciales (PSC) son una fuente disponible no solo para investigación sino también para la creación de fármacos y para transplantes (Wagers A. J. et al., 2002; Griffith L. G. et al., 2002) .

Existen células madre embrionarias y adultas: las primeras derivan de blastocistos de 8 días de edad, mientras que las adultas se pueden obtener principalmente de médula ósea, tejido adiposo o tejido muscular, sangre periférica y de cordón umbilical.

La definición de célula madre está en constante evolución y, en estos momentos, no hay un consenso general ni procedimiento convencional para aislarlas o identificarlas. Para todas estas células, embrionarias (ME) y adultas, se han identificado diversos marcadores genéticos, tanto hematopoyéticos (HSC) como mesenquimatosos (MSC) (Kuwana M. et al., 2003) , algunos de los cuales son comunes a muchos tipos de células (Condomines M. et al., 2006; Kang W. J. et al., 2006; Zhao Y. et al., 2003; Rabinovitch M. et al., 1976) .

En la actualidad, la investigación está más orientada hacia el uso de células madre aisladas de tejido embrionario, fetos y cordón umbilical, lo cual está creando problemas legales y éticos.

Por encima de todo, hasta hoy, el uso de estas células tiene varias contraindicaciones, tales como: riesgo de infección, riesgo de rechazo en caso de transplante y, en algunos mamíferos tales como los caballos, el desarrollo de teratomas.

Para superar estos problemas, en la terapia “in vivo” se conoce el uso de células madre autólogas, aisladas preferentemente de médula ósea, tejido adiposo o sangre periférica. Comenzando a partir de las células madre adultas, existe una etapa de diferenciación “in vitro” (o "ex vivo") de las células madre en la línea celular deseada por medio de factores específicos de inducción de la diferenciación, y una etapa posterior de transplante "in vivo" de la línea celular diferenciada obtenida. En estos procedimientos, existe la desventaja de fenómenos de rechazo, ya que las células diferenciadas, reintroducidas en el organismo afectado, no son reconocidas como células propias, puesto que pierden los factores de autoreconocimiento durante la etapa de diferenciación inducida in vitro.

En el ser humano, la obtención de las células madre de sangre periférica implica su purificación a través de un procedimiento denominado aféresis o leucoaféresis. Las células se extraen de la sangre, se recogen y después se inoculan en los pacientes inmediatamente después de la quimioterapia o la radioterapia.

En la aféresis, que dura de 6 a 8 horas, se extrae la sangre de la vena de un brazo o de una vena del cuello o pecho, y se pasa por una máquina que retira las células madre. La sangre purificada de este modo vuelve al paciente, mientras que las células obtenidas se conservan mediante refrigeración en nitrógeno líquido (Condomines M. et al., 2006; Kang W.J. et al., 2006) . Esta técnica, aparte de ser dolorosa, también es extremadamente estresante para el paciente. Por encima de todo, la técnica no proporciona una discriminación real y/o purificación de las células madre en circulación. Las principales técnicas de purificación conocidas son:

-uso de factores de crecimiento o derivados de plaquetas (TGF-B, VEGF) , pero los costes económicos de la extracción de estas son prohibitivas (Hou M. et al, 2006) ;

-aislamiento de células madre extraídas de la médula ósea, que permite purificar y, por tanto, usar para terapia aproximadamente el 15% de las células contenidas en el material extraído;

-aislamiento de células madre de tejido adiposo, que requiere una extracción quirúrgica previa de cantidades considerables de tejido del donante y no permite la administración intravenosa;

- IGF-1 (factor de crecimiento similar a la insulina 1) conocido como Tendotrofina (Fiedler J. et al., 2006) ;

-UBM (matriz de vejiga urinaria) : esta es un derivado del cerdo, que contiene citoquinas (pero no células nucleadas) , que inducen cicatrización de la herida pero no la regeneración de la zona con la lesión (Zhang YS et al., 2005) .

Otro procedimiento conocido se describe en el artículo de Zhao Y. et al. "A human peripheral blood monocytederived subset acts as pluripotent stem cells" y en el documento WO-A-2004/043990. Este es un procedimiento para preparar células madre derivadas de monocitos, que comprende las etapas de aislar monocitos de sangre periférica, ponerlos en contacto con componente mitogénico y, posteriormente, cultivar los monocitos de sangre periférica en condiciones adecuadas para la propagación de las células.

Este procedimiento, que inicialmente requiere una etapa de aislar el monocito y, después, una etapa de expansión en un medio de cultivo, es muy largo, aproximadamente 15-20 días, para obtener un número significativo de células madre, y no permite obtener células madre pluripotenciales, es decir, no especializadas, adecuadas para inocular directamente y tras un periodo corto de tiempo en el paciente.

De nuevo en el marco de la preparación de células madre a partir de monocitos, también se conocen los documentos WO-A-2005/046570, WO-A-2007/131200 y WO-A-03/083092. No obstante, ya que tienen que levar a cabo una purificación preliminar de la sangre con el fin de aislar únicamente una fracción celular, es decir, los monocitos y una posterior expansión con el fin de obtener las células madre deseadas, los procedimientos descritos en estos documentos llevan mucho tiempo, de nuevo en el orden de 15-40 días, con el fin de obtener una cantidad aceptable de las células madre.

A la luz de lo anterior, existe una necesidad obvia de perfeccionar un procedimiento de expansión, o división y purificación de células madre adultas a partir de fuentes fácilmente accesibles, en particular la sangre, preferentemente sangre periférica, que también permite obtener células madre adecuadas para tratamiento farmacológico.

Asimismo, existe una obvia necesidad de comenzar la producción de células madre de sangre, preferentemente periférica, en el menor tiempo posible, para poder intervenir urgentemente en el paciente.

Por tanto, la finalidad de la presente invención es conseguir un kit para la obtención de sangre, preferentemente sangre periférica, para la producción de células madre pluripotenciales, para permitir un inicio rápido de la producción de células madre pluripotenciales.

El solicitante ha concebido, probado y dado forma a la presente invención para superar los inconvenientes del estado de la técnica y obtener estos y otros propósitos y ventajas.

Sumario de la invención La presente invención se expone y caracteriza en la reivindicación independiente, mientras que las reivindicaciones adjuntas describen otras características de la invención o variantes de la idea principal de la invención.

Un procedimiento para el crecimiento y la purificación in vitro de células madre de sangre, preferentemente sangre periférica, desarrollado por los presentes inventores y descrito en la solicitud de patente internacional. El documento WO 2008/034370 (en la técnica anterior bajo el Artículo 54 (3) EPC) en nombre de la presente solicitud, que se incorpora en el presente documento en su totalidad por referencia, permite obtener células madre pluripotenciales adultas y comprende una primera etapa que tiene dos subetapas:

a) una primera subetapas de crecimiento de las células madre de sangre periférica, después de extraer la sangre, por medio de tratamiento in Vitro con MCSF (factor estimulante de colonias de macrófagos) en una concentración comprendida entre 8-15 nM, preferentemente 10 nM;

b) una segunda subetapas de purificación, preferentemente por medio de fraccionamiento en un gradiente de Ficoll.

La muestra de sangre se introduce en tubos de ensayo que contienen heparina y MCSF.

La primera subetapas de crecimiento puede tener una duración variable de acuerdo con las condiciones en las que se lleva a cabo el tratamiento un vitro, los inventores han... [Seguir leyendo]

1. Kit para la recolección de sangre, preferentemente sangre periférica, para la producción de células madre pluripotenciales, que comprende al menos un primer recipiente (12) capaz de contener la sangre extraída, que contiene un anticoagulante y la sustancia MCSF (factor estimulante de las colonias de macrófago) y al menos un segundo recipiente (18, 20) fabricado con al menos la pared interna de un material que previene la adhesión de las células madre.

2. Kit de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho material es material de plástico, tal como polipropileno (PP) tratado con rayos infrarrojos y/o gamma.

3. Kit de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque comprende un elemento de cierre (24) para 10 cada recipiente (18, 0) .

4. Kit de acuerdo con la reivindicación 1, 2 o 3, caracterizado porque , la concentración de MCSF en el primer recipiente (12) está comprendida entre aproximadamente 2 nM y aproximadamente 20 nM.

5. Kit de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque , la concentración de MCSF en el primer recipiente

(12) está comprendida entre aproximadamente 8 nM y aproximadamente 10 nM.

6. Kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticoagulante es heparina, o EDTA.

7. Kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende un elemento de cierre (22) para el primer recipiente (12) .