Método para hibridar ácidos nucleicos.

Un método para detectar un ácido nucleico diana en una muestra, mediante hibridación con un conjugado de oligonucleótido-oligocatión, que comprende permitir que dicho ácido nucleico reaccione con un conjugado de oligonucleótido-oligocatión que comprende al menos restos Ai y Bj enlazados juntos directamente o vía un ligador, en el que

· Ai es un oligonucleótido i-mero, con i ≥ 3 a 50, en el que Ai es un oligómero con nucleobases de origen natural o no natural y/o grupos pentafuranosilo y/o enlaces de fosfodiéster nativos, que comprende opcionalmente un grupo marcador,

· Bj es un resto oligocatiónico orgánico j-mero, con j ≥ 1 a 50, en el que B es

HPO3-R1-

(NH-R2)n-NH-R3-O-, en el que R1, R2 y R3, idénticos o diferentes, son un radical alquileno de C1-C6, lineal, ramificado o cíclico, opcionalmente sustituido, siendo los restos NH-R2 idénticos o diferentes cuando n es >1;

HPO3-R1-CH(X)-R3-O-, en el que R1 y R3, idénticos o diferentes, son un radical alquileno de C1-C6, lineal, ramificado o cíclico, opcionalmente sustituido, y X es putrescina, espermidina o un resto de espermina, en el que la estructura de dicho conjugado es la estructura IV

R4-Bj-3'Ai 5'-R6 en la que

- R4 y R6, idénticos o diferentes, son H o un ligador, un desactivador, un marcador, un grupo cromóforo o fluoróforo, biotina, cadena hidrófoba, derivado de colesterol, antígeno, proteína, péptido, azúcar, o grupo fosfato;

en el que dicho ácido nucleico diana es una secuencia específica en un genoma completo; y

en el que dicho método comprende

- usar dicho conjugado como una sonda de hibridación o sonda marcada dualmente en un ensayo de PCR en tiempo real que comprende una ADN o ARN polimerasa en presencia de dicho genoma completo.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IB2008/002789.

Solicitante: POLYPLUS TRANSFECTION.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: BIOPARC - BP 90018 BOULEVARD SEBASTIEN BRANDT 67401 ILLKIRCH CEDEX FRANCIA.

Inventor/es: ERBACHER, PATRICK, LENNE,NATHALIE.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)

PDF original: ES-2537625_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Método para hibridar ácidos nucleicos

La solicitud se refiere a la hibridación de ácidos nucleicos con conjugados de oligonucleótido-oligocatión usados para manipular, aislar, detectar o amplificar ácidos nucleicos y la aplicación de los mismos en el campo de la biología molecular y de diagnóstico.

Las tecnologías a base de ácidos nucleicos se usan ampliamente en investigación celular y molecular y en diagnóstico. Las técnicas se basan en el reconocimiento de la secuencia entre un oligonucleótido sintético y su hebra de ácido nucleico complementaria. La afinidad y especificidad son dos características importantes que determinan la eficiencia de cualquier ensayo a base de hibridación nucleica.

Se han desarrollado diferentes enfoques para mejorar la hibridación de ácidos nucleicos.

Potier et al. 2 se refieren a la síntesis y a las propiedades de hibridación de oligonucleótidos que contienen poliaminas en la posición C-2 de purinas (Chem. Eur. J. 6(22): 4188-4194). Ching-Hsuan Tung et al. 1993 se refieren a oligonucleótidos enlazados a poliaminas para la formación de la triple hélice del ADN (Nucleic Acids Research 21(23): 5489-5494).

Sun et al. 1996 se refieren a la síntesis de oligo-ADN sujeto mediante espermina C-ramificada, y a la estabilidad térmica de los dúplex y triplex (Tetrahedron 52(37): 12775-1229).

Entre ellos, uno es disminuir la repulsión electrostática entre hebras de ácidos nucleicos negativamente cargadas. Recientemente, en el documento WO 27/6992 se describió una síntesis en fase sólida automatizada que consiste en injertar grupos catiónicos en los oligonucleótidos y que se basa totalmente en la química de fosforamidito usada para la síntesis de oligonucleótidos. Se mostró que los conjugados resultantes de oligonucleótido-oligocatión estabilizan la hibridación con una secuencia complementaria corta disminuyendo las repulsiones de fosfato entre hebras (Pons et al., 26). Noir et al. 28 se refieren a la temperatura de hibridación de conjugados de oligonucleótido-oligoespermina (ácidos nucleicos Zip) (J. Am. Chem. Soc. 13: 135-1355).

Al Igual que buscar una aguja en un pajar, la mejora de la detección específica de una secuencia única en una muestra biológica de ácido nucleico compleja, tal como un genoma total, es un reto más difícil. En tal situación, se podría esperar que la parte catiónica del conjugado de oligonucleótido-oligocatión se pegue de forma no específica a grupos fosfato de ADN genómico, disminuyendo de ese modo el reconocimiento específico de la secuencia buscada. Esta preocupación se puede agudizar más cuando el policatión es una poliamina, como se ejemplifica en el documento WO 27/6992 y en (Pons et al., 26). De hecho, las poliaminas tales como espermina o espermidina interaccionan de forma natural con ADN genómico en células procariotas y eucariotas (repasado en Tabor y Tabor, 1984; Pegg et al., 1986). Además, se establece que la afinidad de unión y la especificidad de la secuencia se correlacionan generalmente de forma negativa, debido al mecanismo que gobierna la interacción del emparejamiento de bases de los ácidos nucleicos (Demidov y Frank-Kamenetskii, 24). En consecuencia, se espera que los conjugados de oligonucleótido-oligocatión usados para buscar una secuencia específica en un genoma completo toleren desemparejamientos, dando como resultado una disminución de la especificidad.

La solicitud describe el hallazgo inesperado de que una selección específica de conjugados de oligonucleótido- oligocatión a partir de moléculas descritas en el documento WO 27/6992 demuestra una afinidad muy elevada y sorprendentemente una estricta especificidad por su secuencia diana, dando como resultado una mejora general de los métodos a base de hibridación. Se mostró particularmente que dichos conjugados de oligonucleótido-oligocatión mejoran la reacción en cadena de la polimerasa.

De forma ventajosa, dichos conjugados de oligonucleótido-oligocatión son particularmente eficientes en comparación con oligonucleótidos estándar como cebadores y sondas. "Oligonucleótidos estándar" designa oligonucleótidos sin modificar que contienen nucleobases naturales.

Un objeto de la solicitud es proporcionar entonces un método de hibridación que usa conjugados específicos de oligonucleótido-oligocatión a fin de seleccionar ácidos nucleicos.

Otro objeto de la solicitud se refiere al uso de los conjugados de oligonucleótido-oligocatión como cebadores o sondas.

Todavía según otro objeto, la solicitud se refiere a las aplicaciones biológicas de dichos conjugados.

El método para detectar, aislar, amplificar o manipular un ácido nucleico diana en una muestra mediante hibridación con un conjugado de oligonucleótido-oligocatión comprende permitir que dicho ácido nucleico reaccione con un conjugado de oligonucleótido-oligocatión que comprende al menos restos A y Bj enlazados juntos directamente o vía un ligador, en el que

Aj es un oligonucleótido i-mero, con i = 3 a 5, en el que Aj es un oligómero con nucleobases de origen natural o no natural y/o grupos pentafuranosilo y/o enlaces de fosfodiéster nativos, que comprende

opcionalmente un grupo marcador

Bj es un resto oligocatiónico orgánico j-mero, con j = 1 a 5, en el que B es

HP3-Ri-(NH-R2)n-NH-R3-O-, en el que R-i, R2 y R3 son alquileno inferior, idéntico o diferente, siendo los restos NH-R2 idénticos o diferentes cuando n es >1;

HP3-Ri-CH(X)-R3--, en el que R1 y R3, idénticos o diferentes, son alquileno inferior, y X es putrescina, espermidina o un resto de espermina.

"Alquileno inferior", como se usa en la descripción y en las reivindicaciones, designa un radical alquileno lineal, ramificado o cíclico, de C1-C6 opcionalmente sustituido.

A¡ se selecciona del grupo que comprende desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, y nucleobases de origen no natural tales como nucleótidos bloqueados (LNA), PNA así como sus modificaciones químicas o sustituciones tales como grupos fosforotioato (también denominado tiofosfato), 2-fluoro o 2-O-alquilo.

A¡ puede comprender un grupo cromóforo/fluoróforo y/o un grupo desactivador, o un resto químico tal como un modificador amino o tiol, grupo espaciador, biotina, cadena hidrófoba, derivado de colesterol, antígeno, proteína, péptido, grupo fosfato, o azúcar.

En una primera realización, un grupo -OH libre está presente en la posición 3 de A¡. De este modo, el conjugado de oligonucleótido-oligocatión es útil como sustrato para ADN o ARN polimerasas.

En esta primera realización, el conjugado de oligonucleótido-oligocatión es de este modo útil como un cebador para la síntesis de ácidos nucleicos.

Los conjugados mixtos de oligonucleótido-oligocatión según dicha primera realización tienen estructura I

HO-3Ai5'-Bj-R4

o estructura II

HO-3A¡5-R5-Bj-R4

o estructura III

HO-3A¡i5-Bj-A¡2-R4

en las que

A¡1 y A¡2, idénticos o diferentes, son como se definen anteriormente para A¡; estando A¡2 orientado 3-5 o 5-3,

R4 es H o un ligador, un desactivador, un marcador tal como un grupo cromóforo o fluoróforo, o un resto químico tal como biotina, cadena hidrófoba, derivado de colesterol, antígeno, proteína, péptido, azúcar o grupo fosfato;

R5, diferente de H, A¡ y Bj, es un ligador entre A¡ y Bj, y consiste en un ligador químicamente estable o escindible.

La solicitud se refiere así a un método tal como se define anteriormente, en el que una molécula de estructura I, II o III se usa como cebador tras la unión a un ácido nucleico diana.

Tal método comprende ventajosamente las etapas de:

incubar un cebador tal como se describe... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para detectar un ácido nucleico diana en una muestra, mediante hibridación con un conjugado de oligonucleótido-oligocatión, que comprende permitir que dicho ácido nucleico reaccione con un conjugado de oligonucleótido-oligocatión que comprende al menos restos A¡ y Bj enlazados juntos directamente o vía un ligador, en el que

A¡ es un oligonucleótido ¡-mero, con i = 3 a 5, en el que A¡ es un oligómero con nucleobases de origen natural o no natural y/o grupos pentafuranosilo y/o enlaces de fosfodiéster nativos, que comprende opcionalmente un grupo marcador,

Bj es un resto oligocatiónico orgánico j-mero, con j = 1 a 5, en el que B es

HP3-Ri-(NH-R2)n-NH-R3--, en el que R-i, R2 y R3, idénticos o diferentes, son un radical alquileno de C1-C6, lineal, ramificado o cíclico, opclonalmente sustituido, siendo los restos NH-R2 idénticos o diferentes cuando n es >1;

HP3-Ri-CH(X)-R3--, en el que R1 y R3, Idénticos o diferentes, son un radical alquileno de C1-C6, lineal, ramificado o cíclico, opcionalmente sustituido, y X es putrescina, espermidina o un resto de espermina,

en el que la estructura de dicho conjugado es la estructura IV

R4-Bj-3A¡5-R6

en la que

R4 y R6, Idénticos o diferentes, son H o un ligador, un desactivados un marcador, un grupo cromóforo o fluoróforo, biotina, cadena hidrófoba, derivado de colesterol, antígeno, proteína, péptido, azúcar, o grupo fosfato;

en el que dicho ácido nucleico diana es una secuencia específica en un genoma completo; y en el que dicho método comprende

usar dicho conjugado como una sonda de hibridación o sonda marcada dualmente en un ensayo de PCR en tiempo real que comprende una ADN o ARN pollmerasa en presencia de dicho genoma completo.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho genoma completo es ADN genómico.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que los nucleótidos de A¡ se seleccionan del grupo que consiste en desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos bloqueados (LNA), PNA así como sus modificaciones químicas o sustituciones por grupos fosforotioato, 2-fluoro o 2-O-alquilo.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho conjugado se usa como una sonda marcada dualmente en dicho ensayo de PCR en tiempo real.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que B es HP3-(CH2)4-NH2+-(CH2)3-NH2+-(CH2)4- NH2+-(CH2)3-NH2+-(CH2)4--.

6. El método de la reivindicación 5, en el que j = 4.

7. El método de la reivindicación 5 ó 6, en el que R4 es un desactivador, y R6 es un fluoróforo.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en el que los nucleótidos de A¡ son desoxirribonucleótidos.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que al menos un conjugado de oligonucleótido- oligocatión se usa como una sonda para distinguir entre un ácido nucleico diana de tipo salvaje y un muíante.

1. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que al menos un conjugado de oligonucleótido- oligocatión se usa como una sonda para la discriminación alélica.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que al menos un conjugado de oligonucleótido- oligocatión se usa como una sonda para detectar mutaciones.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y 11, en el que al menos un conjugado de oligonucleótido-oligocatión se usa como una sonda para detectar SNP.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que dicho conjugado se usa como una sonda de detección en tiempo real en un ensayo de nucleasa de 5 diseñado para amplificar el gen del Factor V humano.