Filtración de un líquido que comprende una proteína de estrés de plantas.

Método para recuperar una proteína de estrés a partir de una planta, que comprende

- obtener un líquido que comprende la proteína de estrés a partir de la planta;

- precipitar uno o más componentes distintos de la proteína de estrés del líquido;

- adicionar un auxiliar del filtro fibroso y un polvo mineral al líquido; después

- someter el líquido que comprende la proteína de estrés, el

(los) componente(s) precipitado(s), el auxiliar del filtro fibroso y el polvo mineral a una primera etapa de filtración sobre un filtro, lo que separa de esta manera el precipitado, el auxiliar del filtro fibroso y el polvo mineral del filtrado que comprende la proteína de estrés; después de eso

- someter el filtrado a una etapa de filtración adicional; y después de eso

- purificar la proteína de estrés.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2010/054723.

Solicitante: Alfa Biogene International B.V.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: Industrie Strasse 9 48455 Bad Bentheim ALEMANIA.

Inventor/es: SEIFARTH,FRIEDRICH C, LAX,JULIA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/415 (de vegetales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Procedimientos generales de preparación de péptidos > C07K1/34 (por filtración, ultrafiltración u ósmosis inversa)

PDF original: ES-2524541_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Filtración de un líquido que comprende una proteína de estrés de plantas La invención se refiere a un método para recuperar una proteína de estrés a partir de una planta.

Las proteínas de estrés (denominadas además proteínas chaperonas) se forman por microorganismos, plantas y animales especialmente cuando, como resultado de un cambio en el medio ambiente tal como la exposición al calor, radiación o productos químicos, se expresan los denominados genes susceptibles al estrés. De acuerdo con los puntos de vista actuales, tales proteínas pueden contribuir a una protección contra los efectos perjudiciales resultantes de tales cambios ambientales. Por esa razón, el uso de proteínas de estrés está en el centro de interés de, entre otras cosas, la medicina, la biología molecular, la industria cosmética y la industria que desarrolla productos para la protección de plantas.

Se sabe que las proteínas de estrés tienen una serie de importantes funciones terapéuticas naturales en plantas y animales, que incluyen a los seres humanos. Estas proteínas están implicadas como reguladoras en la síntesis de proteínas y el plegamiento de proteínas. Además, una función importante reside en la regulación de la función de genes durante el crecimiento, pero además durante la muerte celular. Las proteínas de estrés son capaces de estimular el sistema inmunológico tanto en seres humanos como en animales, y la investigación clínica ha demostrado que las proteínas chaperonas contribuyen positivamente en la lucha contra el cáncer.

Sin embargo, la disponibilidad de proteínas de estrés tales como la HSP70 y otras proteínas de choque térmico es un problema ya que frecuentemente se aíslan a partir de cerebro bovino. Además de las pequeñas cantidades que pueden aislarse a partir de allí y el extremadamente alto costo acompañante, la posible presencia de BSE en el encéfalo es un gran impedimento para el uso de estas proteínas. La HSP70 puede producirse además a partir de microorganismos y células cancerosas, pero estos métodos de producción también son caros y sólo dan un rendimiento bajo.

Las alternativas a la producción de las proteínas de estrés, particularmente para usos médicos, se encuentran en el campo de la producción de proteínas de fusión con la ayuda de sistemas de expresión. Los posibles problemas que pueden continuar existiendo son el precio elevado y las pequeñas cantidades que se pueden producir.

Las proteínas de estrés de origen vegetal podrían ofrecer una alternativa. Debido a que la producción de proteínas de estrés depende de la condición en que está la célula, un cambio en las circunstancias fuera de la célula puede aumentar enormemente la síntesis de las proteínas de estrés en la célula vegetal.

El documento WO 2005/049645 describe un método para recuperar una proteína de choque térmico, que comprende someter un fluido que comprende la proteína de choque térmico a (a) precipitación; después de eso a (b) al menos una separación por intercambio de iones; y después de eso a (c) al menos una separación por afinidad. Aunque tal método es adecuado para obtener proteínas de choque térmico con un alto grado de pureza y actividad, pueden presentarse problemas con respecto a un bloqueo de la línea del proceso después de la precipitación, particularmente cuando el proceso se lleva a cabo a escala industrial.

Los inventores han evaluado varias técnicas de separación para el precipitado, tales como centrifugación o una técnica de filtrado convencional las que se han encontrado ser problemáticas, especialmente cuando se emplean a escala industrial.

Particularmente se han observado problemas con respecto al bloqueo durante una purificación adicional de la proteína, especialmente en una unidad de concentración de proteína de estrés (por ejemplo una unidad de ultrafiltración) , una unidad de diálisis y/o una unidad de cromatografía después del precipitado. Es un hallazgo de los inventores que tal problema ocurre especialmente cuando la proteína de estrés se recupera a partir de hojas.

Adicionalmente, se encontró que la separación basada en fuerzas centrífugas (usando un separador de discos (SC6-06-576, Westfalia) , 12000 rpm) fue insatisfactoria. Se contempla que la fuerza g requerida para efectuar la separación es mayor que la alcanzable con el separador de discos que se usó, para hacer que esta técnica sea práctica a escala industrial. Cuando se usó la decantación, se observó una considerable formación de espuma en el flujo inferior que comprende la HSP, dicha formación de espuma no se desea ya que puede causar desbordamientos de espuma fácilmente (con la pérdida de producto) y debido al contacto íntimo con el aire la proteína de estrés tiende a sufrir oxidación.

Es un objetivo de la invención proporcionar un nuevo método para recuperar una proteína de estrés, en particular un método que pueda emplearse satisfactoriamente a una escala industrial.

Es un objetivo adicional de la invención proporcionar un nuevo método con menor tendencia al bloqueo de los equipos usados en una etapa de purificación de la proteína de estrés.

Es un objetivo adicional de la invención proporcionar un nuevo método que permita la recuperación de una proteína de estrés a partir de un líquido, particularmente de un jugo de la planta, con un alto rendimiento y una pureza satisfactoria.

Uno o más de otros objetivos que pueden resolverse de acuerdo con la invención son evidentes a partir de la presente descripción y/o reivindicaciones.

Ahora se ha encontrado que es posible cumplir con uno o más de dichos objetivos mediante la adición de agentes auxiliares específicos al líquido que comprende la proteína de estrés, obtenido a partir de una planta.

En consecuencia, la presente invención se refiere a un método para recuperar una proteína de estrés a partir de una planta, que comprende someter a filtración un líquido que comprende proteína de estrés, obtenido a partir de una planta, en donde para la filtración se usa un agente auxiliar de filtro fibroso y un polvo mineral.

En particular, la presente invención se refiere a un método para recuperar una proteína de estrés a partir de una planta, que comprende a) obtener un líquido que comprende la proteína de estrés a partir de la planta; b) precipitar uno o más componentes distintos de la proteína de estrés del líquido; c) adicionar un auxiliar de filtro fibroso y un polvo mineral al líquido; después d) someter el líquido que comprende la proteína de estrés, el (los) componente (s) precipitado (s) , el auxiliar de filtro fibroso y el polvo mineral a una primera etapa de filtración, lo que separa de esta manera el (los) componente (s) precipitado (s) , el auxiliar de filtro fibroso y el polvo mineral del filtrado que comprende la proteína de estrés; después de eso e) someter el filtrado de la filtración (d) a una segunda etapa de filtración, particularmente una etapa de pulido; y adicionalmente f) purificar la proteína de estrés.

La invención se refiere además al uso de al menos un polvo mineral seleccionado del grupo de tierra de diatomeas y perlita para eliminar al menos un compuesto seleccionado del grupo de clorofila, carotenoides y lípidos de un líquido, particularmente de un jugo de la planta, que contiene una proteína de estrés, particularmente una proteína de choque térmico. En una modalidad específica, el polvo mineral se usa en combinación con partículas fibrosas orgánicas.

De acuerdo con la invención, se ha encontrado que es posible aumentar la productividad del fluido a partir del que se va a aislar la proteína de estrés en comparación con un método de acuerdo con WO 2005/049645... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para recuperar una proteína de estrés a partir de una planta, que comprende -obtener un líquido que comprende la proteína de estrés a partir de la planta;

-precipitar uno o más componentes distintos de la proteína de estrés del líquido; -adicionar un auxiliar del filtro fibroso y un polvo mineral al líquido; después -someter el líquido que comprende la proteína de estrés, el (los) componente (s) precipitado (s) , el auxiliar del filtro fibroso y el polvo mineral a una primera etapa de filtración sobre un filtro, lo que separa de esta manera el precipitado, el auxiliar del filtro fibroso y el polvo mineral del filtrado que comprende la proteína de estrés;

después de eso -someter el filtrado a una etapa de filtración adicional; y después de eso -purificar la proteína de estrés.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en la primera etapa de filtración la clorofila y/o rubisco se 15 separan del líquido.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en donde el polvo mineral comprende al menos un mineral granular.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende al menos un mineral granular seleccionado del grupo de 20 tierra de diatomeas y perlita.

5. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el auxiliar del filtro fibroso comprende fibras de celulosa.

6. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el auxiliar del filtro fibroso es una mezcla de fibras que tienen una longitud diferente, la mezcla proporciona al menos fibras con una longitud en el intervalo de aproximadamente 20 μm a aproximadamente 130 μm.

7. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la etapa de filtración adicional a 30 la cual se somete el filtrado es una etapa de filtración de profundidad.

8. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde después de la etapa de filtración adicional, una fracción que comprende la proteína de estrés se somete a una etapa de eliminación de fluido lo que concentra así la proteína de estrés en la fracción, preferentemente mediante ósmosis inversa, ultrafiltración o nanofiltración, y/o a una etapa de eliminación de sal, preferentemente mediante diálisis.

9. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde la proteína de estrés se purifica mediante cromatografía.

10. Método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la cromatografía comprende una primera etapa de intercambio aniónico fuerte, después de eso una etapa de separación mediante cromatografía de afinidad, y después de eso una segunda etapa de intercambio aniónico fuerte.

11. Método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la mediana del tamaño de partícula del material de 45 intercambio usado en el primer intercambio aniónico es mayor que la mediana del tamaño de partículas del material de intercambio usado en el segundo intercambio aniónico.

12. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la proteína de estrés es una proteína de estrés de una planta seleccionada del grupo de Fabaceae, Chenopodiaceae, Solanaceae y Poaceae, 50 particularmente del grupo de la alfalfa, el trigo, el maíz, el arroz, la soya, la patata, la remolacha, más particularmente la alfalfa.

13. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la proteína de estrés se selecciona del grupo de HSP40, HSP60, HSP70 y HSP90.

14. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el filtrado de la primera etapa de filtración se somete a dicha etapa de filtración adicional sin haberse sometido primero a centrifugación.

15. El uso de al menos un mineral granular seleccionado del grupo de tierra de diatomeas y perlita para eliminar clorofila y/o carotenoides de un líquido, particularmente un Jugo de la planta, que contiene una proteína de choque térmico de la planta.