Métodos para extender el rango dinámico en ensayos para la detección de moléculas o partículas.

Un método para determinar una medida de la concentración de moléculas o partículas de analito en una muestra de líquidos

, que comprende:

exponer una pluralidad de objetos de captura, incluyendo cada uno de ellos una superficie de unión que tenga afinidad por al menos un tipo de molécula o partícula de analito, con una solución que contenga, o que se sospeche que contenga, el al menos un tipo de moléculas o partículas de analito, en el que al menos algunos de los objetos de captura comienzan a asociarse con al menos una molécula o partícula de analito;

segregar espacialmente al menos una parte de los objetos de captura sometidos a la etapa de exposición en una pluralidad de lugares;

tratar al menos algunos de la pluralidad de lugares y determinar una medida indicativa del porcentaje de dichos lugares que contengan un objeto de captura asociado con al menos una molécula o partícula de analito, en el que los lugares tratados son lugares que contienen al menos un objeto de captura; y

basándose en el porcentaje, determinar una medida de la concentración de las moléculas o partículas de analito en la muestra de líquidos basándose al menos en parte en el número de lugares que contienen un objeto de captura asociado con al menos una molécula o partícula de analito, o determinar una medida de la concentración de las moléculas o partículas de analito en la muestra de líquidos basándose al menos en parte en un nivel de intensidad medido de una señal que es indicativo de la presencia de una pluralidad de moléculas o partículas de analito.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2011/026665.

Solicitante: Quanterix Corporation.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 113 Hartwell Avenue Lexington, MA 02421 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: FOURNIER,DAVID, RISSIN,DAVID M, DUFFY,DAVID C.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de los materiales por... > G01N21/64 (Fluorescencia; Fosforescencia)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/543 (con un soporte insoluble para la inmovilización de compuestos inmunoquímicos)

PDF original: ES-2544635_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Métodos para extender el rango dinámico en ensayos para la detección de moléculas o partículas

En el presente documento se describen sistemas y métodos para extender el rango dinámico de ensayos analíticos y sistemas usados para determinar una concentración de moléculas o partículas de analito en una muestra de líquidos.

Solicitudes reiacionadas

Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° de Serie 61/441.894, presentada el 11 de febrero, 2011, titulada "Methods and Systems for Extending Dynamic Range in Assays forthe Detection of Moléculas of Particles", de Rissin ef a/. Esta solicitud también es una continuación en parte de la Solicitud de Patente de Estados Unidos N° de Serie 12/731.136, presentada el 24 de marzo, 2010, titulada "Methods and Systems for Extending Dynamic Range in Assays for the Detection of Molecules or Particles" de Rissin ef a/., que reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° de Serie 61/309.165, presentada el 1 de marzo, 2010, titulada "Methods and Systems for Extending Dynamic Range in Assays for the Detection of Molecules or Particles" de Rissin ef a/.

Antecedentes de la Invención

Los métodos y sistemas que son capaces de detectar de manera rápida y precisa y, en determinados casos, cuantificar una molécula de analito diana en una muestra, son las piedras angulares de las mediciones analíticas modernas. Dichos sistemas y métodos se emplean en muchas áreas, tales como en investigación académica e industrial, evaluación ambiental, seguridad alimentaria, diagnóstico médico y detección de agentes de armamento químico, biológico y radiológico. Las características ventajosas de dichas técnicas pueden incluir, especificidad, velocidad y sensibilidad.

Muchos de los métodos y técnicas conocidos están limitados por el rango dinámico de las concentraciones que los métodos y técnicas pueden detectar de manera precisa (por ejemplo, rango dinámico limitado) y/o que no tienen la sensibilidad para detectar moléculas o partículas cuando están presentes a concentraciones muy bajas.

Por consiguiente, se requieren sistemas y métodos mejorados para extender el rango dinámico de ensayos analíticos y sistemas usados para determinar una medida de la concentración de moléculas o partículas en una muestra de líquidos.

Los documentos WO 2007/098148 y WO 2009/029073, desvelan un método para detectar un analito diana en una muestra, comprendiendo el método: a) proporcionar una muestra y una matriz, comprendiendo dicha muestra un analito de biomolécula diana, comprendiendo dicha matriz al menos 1000 sitios, teniendo cada sitio un volumen definido entre 10 attolitros y 50 picolitros; b) poner en contacto dicha matriz con dicha muestra de tal manera que la proporción de analito de biomolécula diana con cada sitio de dicha matriz sea menor de 1:1; ye) determinar el número de sitios de dicha matriz que contiene una sola biomolécula; en el que el porcentaje de sitios que contienen una sola molécula proporciona una medida de la concentración de moléculas en dicha muestra.

Sumario de la Invención

En el presente documento se describen métodos para extender el rango dinámico de métodos analíticos y sistemas usados para determinar la concentración de moléculas o partículas de analito en una muestra de líquidos. La materia objeto de la presente invención implica, en algunos casos, productos interrelacionados, soluciones alternativas a un problema particular, y/o una pluralidad de diferentes usos de uno o más sistemas y/o artículos.

En algunas realizaciones, un método para determinar una medida de la concentración de moléculas o partículas de analito en una muestra de líquidos comprende exponer una pluralidad de objetos de captura, incluyendo cada uno una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula o partícula de analito, con una solución que contiene o que se sospecha que contiene al menos un tipo de moléculas o partículas de analito, en el que al menos algunos de los objetos de captura se asocian con al menos una molécula o partícula de analito, segregando espacialmente al menos una parte de los objetos de captura sometidos a la etapa de exposición en una pluralidad de lugares, localizando al menos alguna de la pluralidad de lugares y determinando una medida indicativa del porcentaje de dichas lugares que contienen un objeto de captura asociado con al menos una molécula o partícula de analito, en el que los lugares localizados son lugares que contienen al menos un objeto de captura, y se basan en el porcentaje, bien determinando una medida de la concentración de moléculas o partículas de analito en la muestra de líquidos basada al menos en parte en el número de lugares que contienen un objeto de captura asociado con al menos una molécula o partícula de analito, o determinando una medida de la concentración de las moléculas o partículas de analito en la muestra de líquidos basada al menos en parte en un nivel de intensidad medido de una señal que es indicativa de la presencia de una pluralidad de moléculas o partículas de analito.

Breve descripción de ios dibujos

El ámbito de protección de la presente Invención se define en las reivindicaciones que conciernen a un método para determinar una medida de la concentración de moléculas o partículas de anallto en una muestra de líquidos. Otros sistemas y métodos que se describen en el presente documento se Incluyen con motivos de referencia y no forman parte de la Invención reivindicada.

Otros aspectos, realizaciones y características de la Invención resultarán obvios a partir de la siguiente descripción detallada cuando se consideran un conjunto con los dibujos adjuntos. Las figuras que se adjuntan son esquemáticas y no están dibujadas a escala. Para fines de claridad, en cada figura no se marcan todos los componentes, ni se muestra cada componente de cada realización de la Invención ya que la ilustración no es necesaria para permitir que los expertos habituales en la técnica comprendan la Invención.

La FIG. 1 muestra una representación gráfica de resultados de un ajuste a la distribución de Poisson, realizada de acuerdo con algunas realizaciones;

la FIG. 2 muestra un gráfico del número promedio de enzimas unidas por perla frente a la concentración de enzimas en una muestra de líquidos, de acuerdo con una realización;

la FIG. 3 muestra un gráfico del número promedio de enzimas unidas por perla frente a la concentración de enzimas en una muestra de líquidos, de acuerdo con una realización, en el que el número promedio de enzimas unidas por perla se calcula usando dos métodos analíticos diferentes;

la FIG. 4A muestra una representación gráfica de la fracción de perlas activas frente a la concentración efectiva de analito, dada por el promedio de moléculas por perla (AMB, Average Mo/ecu/e per Bead) determinado a partir del recuento digital usando la distribución de Poisson, de acuerdo con una realización;

la FIG. 4B muestra una representación gráfica de la intensidad analógica (Iperia/lsoia) como una función de la concentración efectiva, AMB, de acuerdo con una realización;

la FIG. 4C muestra una representación gráfica de la imprecisión del AMB (% CV) como una función del número de perlas activas de (I) análisis digital y (¡I) análisis analógico, de acuerdo con una realización;

la FIG. 5A muestra un diagrama esquemático de un protocolo de ensayo de una realización de la presente Invención, en el que AMB = 0,1 (Izquierda), AMB = 0,6 (centro), y AMB = 3;

las FIGS. 5B-D muestran Imágenes de fluorescencia generadas de acuerdo con algunas realizaciones usando un ensayo de perlas Individualizadas en pocilios... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para determinar una medida de la concentración de moléculas o partículas de anallto en una muestra de líquidos, que comprende:

exponer una pluralidad de objetos de captura, incluyendo cada uno de ellos una superficie de unión que tenga afinidad por al menos un tipo de molécula o partícula de analito, con una solución que contenga, o que se sospeche que contenga, el al menos un tipo de moléculas o partículas de analito, en el que al menos algunos de los objetos de captura comienzan a asociarse con al menos una molécula o partícula de anallto;

segregar espaclalmente al menos una parte de los objetos de captura sometidos a la etapa de exposición en una pluralidad de lugares;

tratar al menos algunos de la pluralidad de lugares y determinar una medida indicativa del porcentaje de dichos lugares que contengan un objeto de captura asociado con al menos una molécula o partícula de analito, en el que los lugares tratados son lugares que contienen al menos un objeto de captura; y

basándose en el porcentaje, determinar una medida de la concentración de las moléculas o partículas de analito en la muestra de líquidos basándose al menos en parte en el número de lugares que contienen un objeto de captura asociado con al menos una molécula o partícula de analito, o determinar una medida de la concentración de las moléculas o partículas de anallto en la muestra de líquidos basándose al menos en parte en un nivel de intensidad medido de una señal que es indicativo de la presencia de una pluralidad de moléculas o partículas de analito.

2. El método la reivindicación 1, en el que cuando el porcentaje de dichos lugares que contienen al menos un objeto de captura que contiene un objeto de captura asociado con al menos una molécula o partícula de analito, es menor de aproximadamente 40 % la medida de la concentración de las moléculas o partículas de analito en la muestra de líquidos se basa, al menos en parte, en el número de lugares que contiene al menos una molécula o partícula de analito.

3. El método de la reivindicación 1, en el que cuando el porcentaje de dichos lugares que contienen al menos un objeto de captura que contiene un objeto de captura asociado con al menos una molécula o partícula de analito es mayor de aproximadamente 30 % la medida de la concentración de las moléculas o partículas de analito en la muestra de líquidos se basa al menos en parte en un nivel de intensidad de al menos una señal indicativa de la presencia de una pluralidad de moléculas o partículas de analito.

4. El método de la reivindicación 1, en el que cuando el porcentaje de dichos lugares que contienen al menos un objeto de captura que contiene un objeto de captura asociado con al menos una molécula o partícula de analito está entre aproximadamente el 30 % y aproximadamente el 50 % la medida de la concentración de las moléculas o partículas de anallto en la muestra de líquidos es un promedio, la medida de la concentración de moléculas o partículas de anallto en la muestra de líquidos se basa al menos en parte en el número de lugares que contienen al menos una molécula o partícula de anallto y la medida de la concentración de las moléculas o partículas de analito en la muestra de líquidos se basa al menos en parte en un nivel de intensidad de al menos una señal indicativa de la presencia de una pluralidad de moléculas o partículas de anallto.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la medida de la concentración de las moléculas de analito en una muestra de líquidos se basa al menos en parte en un ajuste de la distribución de Polsson.

6. El método de la reivindicación 1, en el que la pluralidad de objetos de captura comprende una pluralidad de perlas.

7. El método de la reivindicación 1, en el que la medida de la concentración de moléculas de anallto en una muestra de líquidos se basa al menos en parte en la comparación de un parámetro medido con una curva de calibración, o en el que la curva de calibración se forma al menos en parte por la determinación de al menos un factor de calibración, opcionalmente, en el que el factor de calibración se determina usando una muestra de calibración y en el que el porcentaje de lugares que contiene objetos de captura asociados con al menos una molécula de analito es entre aproximadamente el 30 % y aproximadamente el 50 %.

8. El método de la reivindicación 1, en el que la pluralidad de lugares comprende una pluralidad de recipientes de reacción, preferentemente en el que el volumen promedio de la pluralidad de recipientes de reacción es entre aproximadamente 10 attolltros y aproximadamente 100 plcolltros.

9. El método de la reivindicación 1, en el que la concentración de las moléculas o partículas de anallto en la muestra de líquidos es menor de aproximadamente 50x10"^ M.

10. El método de la reivindicación 1, en el que el porcentaje de lugares tratados en la etapa de tratamiento es al

menos aproximadamente el 5 % del número total de lugares.

11. El método de la reivindicación 1, en el que las moléculas o partículas de anallto son proteínas o ácidos nucleicos.

5 12. El método de la reivindicación 1, en el que las moléculas de anallto se exponen a al menos un ligando de unión

en condiciones tales que sustanclalmente todas las moléculas de anallto se asocian a al menos un ligando de unión.

13. El método de la reivindicación 12 en el que el al menos un ligando de unión comprende un componente enzimàtico.

14. El método de la reivindicación 12, que adlclonalmente comprende exponer las moléculas o partículas de anallto a un agente marcador precursor, preferentemente en el que el agente marcador precursor se transforma en un agente marcador después de la exposición al componente enzimàtico.

15 15. El método de la reivindicación 14, en el que el agente marcador precursor se transforma en un agente marcador

después de la exposición al componente enzimàtico y en el que la presencia de una molécula o partícula de anallto en un lugar se determina determinando la presencia de al menos un agente marcador precursor.