Composiciones y métodos para alterar el contenido de alfa- y beta-tocotrienol.

Una planta transformada que comprende en su genoma

(a) una primera molécula de ácido nucleico recombinante que comprende al menos una secuencia reguladora ligada operativamente a al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(i) una secuencia de nucleótidos fijada en la SEQ ID NO: 15;

(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos fijada en la SEQ ID NO: 16;

(iii) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de nucleótidos establecida en (i) ó (ii), donde la secuencia de nucleótidos codifica una gamma-tocoferol metiltransferasa; y

(iv) una secuencia de nucleótidos que es completamente complementaria a la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de (i) a (iii); y

(b) una segunda molécula de ácido nucleico recombinante que comprende al menos una secuencia reguladora ligada operativamente a al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(v) una secuencia de nucleótidos fijada en la SEQ ID NO: 1;

(vi) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos fijada en la SEQ ID NO: 2;

(vii) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos establecida en (v) ó (vi), donde la secuencia de nucleótidos codifica una homogentisato geranilgeranil transferasa; y

(viii) una secuencia de nucleótidos que es completamente complementaria a la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de (v) a (vii),

donde la primera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico se incorporan de forma estable en el genoma de la planta transgénica.

Composiciones y métodos para alterar el contenido de alpha- y beta-tocotrienol

Campo de la Invención El campo de la invención se refiere al cultivo de plantas y a biología molecular, y particularmente a la alteración del fenotipo de aceite en plantas a través del uso de fragmentos de ácido nucleico que codifican homogentisato geranilgeranil transferasa y gamma-tocoferol metiltransferasa.

Antecedentes Los tocotrienoles son compuestos relacionados con la vitamina E cuya presencia en plantas se limita principalmente a las semillas y los frutos de la mayoría de las especies monocotiledóneas (p. ej., palma, trigo, arroz y cebada) . Los tocotrienoles son estructuralmente similares a los tocoferoles, que incluyen α-tocoferol o vitamina E, que tiene presencia en todo el reino vegetal, así como en microbios fotosintéticos como el Synechocystis.

Los tocotrienoles y los tocoferoles contienen ambos un grupo de cabeza de cromanol que está unido a una cadena lateral de hidrocarburo. La única diferencia estructural entre estas moléculas es la presencia de tres dobles enlaces en la cadena lateral de hidrocarburo de los tocotrienoles. Esta diferencia está relacionada con el origen biosintético de las cadenas laterales. Las cadenas laterales de tocoferol derivan de fitil-pirofosfato (PP, del inglés “phytylpyrophosphate”) , y se cree que las cadenas laterales de tocotrienol derivan de geranilgeranil-PP, véanse la Figura 1 y la Figura 2, respectivamente (Soll et al. (1980) Arch. Biochem. Biophys. 204: 544-550) .

En la naturaleza existen al menos cuatro formas o especies moleculares de tocoferoles y tocotrienoles: alfa, beta, gamma y delta (α, β, γ y δ, respectivamente) . Estas especies moleculares contienen un número diferente de grupos metilo ligados a la porción aromática de la cabeza de cromanol. Como los tocoferoles, los tocotrienoles son potentes antioxidantes solubles en lípidos y por lo tanto presentan un considerable valor nutritivo para dietas humanas y de animales (Packer et al. (2001) J. Nutr. 131: 369S-373S) . Adicionalmente, se cree que los tocotrienoles tienen propiedades terapéuticas que incluyen una capacidad demostrada para regular a la baja la biosíntesis de colesterol (Theriault et al. (1999) Clin. Biochem. 32: 309-319; Qureshii et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 10544-10550) .

La primera etapa comprometida de la ruta biosintética del tocoferol es la prenilación de ácido homogentísico con fitildifosfato para formar 2-metil-6-fitilbenzoquinol (MPBQ) . Dos enzimas metiltransferasa distintas catalizan metilaciones del resto aromático de los tocoferoles (VTE3 y VTE4) . La 2-metil-6-fitilbenzoquinol metiltransferasa (VTE3) actúa sobre el intermedio de tocoferol MPBQ antes de la ciclación. La ciclación del producto de la primera reacción de metilación (2, 3-dimetil-5-fitilbenzoquinol) con tocoferol ciclasa (VTE1) proporciona gamma-tocoferol. El gamma-tocoferol vuelve a ser metilado a alfa-tocoferol por la segunda enzima metiltransferasa de la biosíntesis de tocoferol, la gamma-tocoferol metiltransferasa (VTE4) . La misma enzima metila delta-tocoferol generando con ello beta-tocoferol.

Se ha especulado que la primera etapa comprometida de la biosíntesis de tocotrienoles implica la condensación de geranilgeranil-PP y homogentisato para formar 2-metil-6-geranilgeranilbenzoquinol (Soll et al. (1980) Arch. Biochem. Biophys. 204: 544-550) . La enzima que cataliza esta reacción puede, por tanto, describirse funcionalmente como una homogentisato geranilgeranil transferasa (HGGT) . Tras ciclación y una metilación inicial, la última etapa de la producción de tocotrienol requeriría la metilación de gamma-tocotrienol a alfa-tocotrienol o delta-tocotrienol a betatocotrienol.

Se ha publicado la identificación funcional de genes o ADNc que codifican polipéptidos de homogentisato geranilgeranil transferasa (HGGT) y gamma-tocoferol metiltransferasa. Sin embargo, aún no se ha publicado el uso de dichos ácidos nucleicos en combinación para manipular la biosíntesis de los tocotrienoles importantes nutricionalmente, tales como alfa y beta tocotrienol, en plantas, semillas y hospedantes microbianos.

Cahoon et al., (2003) Nature Biotechnol. 21: 1082-1087 describe que la expresión transgénica de ácido homogentísico geranilgeranil transferasa (HGGT) procedente de cebada en hojas de Arabidopsis thaliana dio como resultado la acumulación de tocotrienoles, que estaban ausentes en las hojas en las plantas no transformadas.

El documento WO 2004/081215 describe una molécula de ADN que codifica para una gamma-tocoferol metiltransferasa en maíz y sus aplicaciones.

Sumario de la invención La invención se define en las reivindicaciones. En particular, la presente invención proporciona una planta transformada que comprende en su genoma:

(a) una primera molécula de ácido nucleico recombinante que comprende al menos una secuencia reguladora ligada operativamente a al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(i) una secuencia de nucleótidos fijada en la SEQ ID NO: 15;

(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos fijada en la SEQ ID NO: 16;

(iii) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de nucleótidos establecida en (i) ó (ii) , donde la secuencia de nucleótidos codifica una gamma-tocoferol metiltransferasa; y

(iv) una secuencia de nucleótidos que es completamente complementaria a la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de (i) a (iii) ; y

(b) una segunda molécula de ácido nucleico recombinante que comprende al menos una secuencia reguladora ligada operativamente a al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(v) una secuencia de nucleótidos fijada en la SEQ ID NO: 1;

(vi) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos fijada en la SEQ ID NO: 2;

(vii) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos establecida en (v) ó (vi) , donde la secuencia de nucleótidos codifica una homogentisato geranilgeranil transferasa; y

(viii) una secuencia de nucleótidos que es completamente complementaria a la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de (v) a (vii) ,

donde la primera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico se incorporan de forma estable en el genoma de la planta transgénica.

La presente invención también proporciona semillas, células vegetales, tejidos vegetales, grano y ensilaje de dichas plantas transformadas, donde dicha semilla, célula vegetal, tejido vegetal, grano o ensilaje comprende en su genoma la primera y la segunda moléculas de ácido nucleico recombinante. Preferiblemente, dichas semillas tienen un nivel incrementado de alfa y/o beta-tocotrienol respecto a una semilla con un fondo genético similar pero que carece de la primera y segunda moléculas de ácido nucleico recombinante.

También se proporciona un método para mejorar la calidad del tejido de un animal que comprende alimentar al animal con dichas semillas.

La invención también proporciona un método para aumentar el nivel de alfa tocotrienol o beta tocotrienol en una planta, que comprende incorporar de manera estable en su genoma:

(a) una primera molécula de ácido nucleico recombinante que comprende al menos una secuencia reguladora ligada operativamente a al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(i) una secuencia de nucleótidos fijada en la SEQ ID NO: 15;

(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos fijada en la SEQ ID NO: 16;

(iii) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de nucleótidos establecida en (i) ó (ii) , donde la secuencia de nucleótidos codifica una gamma-tocoferol metiltransferasa; y

(iv) una secuencia de nucleótidos que es completamente complementaria a la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de (i) a (iii) ; y

(b) una segunda molécula de ácido nucleico recombinante que comprende al menos una secuencia reguladora ligada operativamente a al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(v) una secuencia de nucleótidos fijada en la SEQ ID NO: 1;

(vi) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos fijada en la SEQ ID NO: 2;

(vii) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos establecida... [Seguir leyendo]

1. Una planta transformada que comprende en su genoma

(a) una primera molécula de ácido nucleico recombinante que comprende al menos una secuencia reguladora ligada operativamente a al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(i) una secuencia de nucleótidos fijada en la SEQ ID NO: 15;

(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos fijada en la SEQ ID NO: 16;

(iii) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de nucleótidos establecida en (i) ó (ii) , donde la secuencia de nucleótidos codifica una gamma-tocoferol metiltransferasa; y

(iv) una secuencia de nucleótidos que es completamente complementaria a la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de (i) a (iii) ; y

(b) una segunda molécula de ácido nucleico recombinante que comprende al menos una secuencia reguladora ligada operativamente a al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(v) una secuencia de nucleótidos fijada en la SEQ ID NO: 1;

(vi) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos fijada en la SEQ ID NO: 2;

(vii) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos establecida en (v) ó (vi) , donde la secuencia de nucleótidos codifica una homogentisato geranilgeranil transferasa; y

(viii) una secuencia de nucleótidos que es completamente complementaria a la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de (v) a (vii) ,

donde la primera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico se incorporan de forma estable en el genoma de la planta transgénica.

2. La planta transformada de la Reivindicación 1, donde al menos una secuencia reguladora de la primera molécula de ácido nucleico recombinante comprende al menos un promotor seleccionado del grupo que consiste en promotores preferidos de semilla, constitutivos, regulados químicamente, preferidos de tejido y regulados en el desarrollo; donde la al menos una secuencia reguladora de la segunda molécula de ácido nucleico recombinante comprende al menos un promotor seleccionado del grupo que consiste en promotores preferidos de semilla, constitutivos, regulados químicamente, preferidos de tejido y regulados en el desarrollo; y donde el al menos un promotor de la primera molécula de ácido nucleico recombinante es igual o diferente del al menos un promotor de la segunda molécula de ácido nucleico recombinante.

3. La semilla, célula vegetal, tejido vegetal, grano o ensilaje de la planta transformada de la Reivindicación 1, donde dicha semilla, célula vegetal, tejido vegetal, grano o ensilaje comprende en su genoma la primera molécula de ácido nucleico recombinante y la segunda molécula de ácido nucleico recombinante.

4. La planta transformada de la Reivindicación 1, donde dicha planta transformada produce una semilla con una o ambas de la siguientes características, un nivel incrementado de alfa- tocotrienol y de beta-tocotrienol respecto a una planta con un fondo genético similar pero que carece de dicha primera molécula de ácido nucleico recombinante y de dicha segunda molécula de ácido nucleico recombinante.

5. Un método para aumentar el nivel de alfa-tocotrienol o beta-tocotrienol en una planta, que comprende incorporar de forma estable en su genoma

(a) una primera molécula de ácido nucleico recombinante que comprende al menos una secuencia reguladora ligada operativamente a al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(i) una secuencia de nucleótidos fijada en la SEQ ID NO: 15;

(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos fijada en la SEQ ID NO: 16;

(iii) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de nucleótidos establecida en (i) ó (ii) , donde la secuencia de nucleótidos codifica una gamma-tocoferol metiltransferasa; y

(iv) una secuencia de nucleótidos que es completamente complementaria a la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de (i) a (iii) ; y

(b) una segunda molécula de ácido nucleico recombinante que comprende al menos una secuencia reguladora ligada operativamente a al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(v) una secuencia de nucleótidos fijada en la SEQ ID NO: 1;

(vi) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos fijada en la SEQ ID NO: 2;

(vii) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos establecida en (v) ó (vi) , donde la secuencia de nucleótidos codifica una homogentisato geranilgeranil transferasa; y

(viii) una secuencia de nucleótidos que es completamente complementaria a la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de (v) a (vii) ,

donde la primera molécula de ácido nucleico y la segunda molécula de ácido nucleico se incorporan de forma estable en el genoma de la planta transgénica.

6. Un método para producir una planta transformada que presente niveles incrementados de alfa-tocotrienol o betatocotrienol, comprendiendo dicho método incorporar de manera estable en el genoma de una planta una primera y una segunda moléculas de ácido nucleico recombinante, donde:

(a) dicha primera molécula de ácido nucleico recombinante comprende al menos una secuencia reguladora ligada operativamente a al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(i) una secuencia de nucleótidos fijada en la SEQ ID NO: 15;

(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos fijada en la SEQ ID NO: 16;

(iii) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de nucleótidos establecida en (i) ó (ii) , donde la secuencia de nucleótidos codifica una gamma-tocoferol metiltransferasa; y

(iv) una secuencia de nucleótidos que es completamente complementaria a la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de (i) a (iii) ; y

(b) dicha segunda molécula de ácido nucleico recombinante comprende al menos una secuencia reguladora ligada operativamente a al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(v) una secuencia de nucleótidos fijada en la SEQ ID NO: 1;

(vi) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos fijada en la SEQ ID NO: 2;

(vii) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos establecida en (v) ó (vi) , donde la secuencia de nucleótidos codifica una homogentisato geranilgeranil transferasa; y

(viii) una secuencia de nucleótidos que es completamente complementaria a la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de (v) a (vii) .

7. La planta de las 1. 2 ó 4, o el método de la Reivindicación 5 ó de la Reivindicación 6, donde la planta es una monocotiledónea.

8. La planta o el método de la Reivindicación 7, donde la monocotiledónea se selecciona del grupo que consiste en maíz, trigo, arroz, sorgo, cebada, mijo y centeno.

9. La panta de las 1. 2 ó 4, o el método de la Reivindicación 5 ó de la Reivindicación 6, donde la planta es una dicotiledónea.

10. La planta o el método de la Reivindicación 9, donde la dicotiledónea se selecciona del grupo que consiste en soja, Brassica sp., alfalfa, alazor, girasol, algodón, cacahuete, canola, Arabidopsis, tabaco y patata.

11. El método de una cualquiera de las Reivindicaciones 5 a 10, que además comprende obtener semillas, células vegetales, tejidos vegetales, grano, aceite, tocoles o ensilaje a partir de dicha planta.

12. La semilla de la Reivindicación 3, donde la semilla tiene una o ambas características de nivel incrementado de alfa-tocotrienol y de beta-tocotrienol respecto a una semilla con un fondo genético similar pero que carece de dicha primera molécula de ácido nucleico recombinante y de dicha segunda molécula de ácido nucleico recombinante.

13. La semilla de la Reivindicación 12, donde la semilla tiene un nivel de alfa-tocotrienol de al menos 20 ppm.

14. La semilla de la Reivindicación 12, donde la semilla contiene alfa-tocotrienol en una cantidad de al menos el 20% del contenido total de tocoferol y tocotrienol de la semilla.

15. Un método para mejorar la calidad del tejido de un animal, que comprende alimentar al animal con la semilla transformada de una cualquiera de las 1. a 14.

16. El método de la Reivindicación 15, donde el tejido es carne y la calidad de la carne se mide según criterios seleccionados del grupo que consiste en pH incrementado, color de la comida mejorado, estabilidad frente a la oxidación mejorada, aumento de la fecha de caducidad y reducción de la purga.

17. El método de la Reivindicación 15, donde el animal es un rumiante.

18. El método de la Reivindicación 17, donde el animal es ganado vacuno. 10 19. El método de la Reivindicación 15, donde el animal es un no rumiante.

20. El método de la Reivindicación 19, donde el animal es porcino o ave de corral.