Cofactores, dadores y aceptores de ligasa modificados químicamente.

Un método para detectar una mutación en un ácido nucleico diana, dicho método comprendiendo: incubar dicho ácido nucleico diana en una mezcla de reacción comprendiendo una ligasa de ácido nucleico dependiente de un cofactor

, un cofactor de ligasa ATP modificado, un polinucleótido dador y un polinucleótido aceptor, en el que uno o más de dichos cofactores de ligasa ATP, polinucleótido dador y polinucleótido aceptor están modificados; y supervisar la ligadura de los polinucleótidos dador y aceptor, donde la cantidad de ligadura es indicativa de la presencia o la ausencia de la mutación y donde la presencia del cofactor de ligasa ATP modificado mejora la especificidad de ligadura en relación con el cofactor de ligasa ATP no modificado correspondiente.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2010/041069.

Solicitante: TRILINK BIOTECHNOLOGIES.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 9955 MESA RIM ROAD SAN DIEGO, CA 92121 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: ZON,Gerald, LEBEDEV,Alexandre, PAUL,NATASHA, SHUM,JONATHAN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > C12N9/00 (Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas)

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Fragmento de la descripción:

Cofactores, dadores y aceptores de ligasa modificados químicamente REFERENCIA CRUZADA CON LA APLICACIÓN RELACIONADA

Esta aplicación de patente reivindica prioridad sobre la publicación estadounidense Num. 2011/0008788, titulada “Chemically Modified Ligasa Cofactors, Donors and Acceptors”, presentada el 6 de julio de 2009.

DECLARACIÓN DE APOYO GUBERNAMENTAL

El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre la presente invención de conformidad con la Subvención Núm. GM085860 concedida por el Instituto Nacional de Ciencia Médica General.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Se proporcionan aquí métodos y composiciones para ligar ácidos nucleicos. En aspectos y modos de realización particulares, los métodos y composiciones mejoran la especificidad de ligasa entre los ácidos nucleicos diana emparejados y los mal emparejados y/o reducen o inhiben la ligadura independiente del molde utilizando cofactores, dadores y aceptores de ligasa modificados y combinaciones de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se proporciona la siguiente descripción para ayudar al entendimiento del lector. Ninguna información proporcionada o ninguna referencia citada se admiten como técnica anterior a la presente invención.

Las ligasas de ácido nucleico pertenecen a una clase de enzimas que catalizan la formación de enlace fosfodiéster entre los extremos adyacentes 3’-hidroxil y 5’-fosforil en ácido nucleico (p.ej., ARN o ADN) en presencia de un cofactor, como ATP o NAD+. Las ligasas se emplean en un número de aplicaciones de biología molecular incluyendo la detección de secuencia de ácido nucleico, detección de polimorfismo de nucleótido simple (SNP) , detección de proteína, secuenciación por ligadura y reacción en cadena de ligasa (LCR) .

En experimentos de fidelidad bioquímica, se ha descubierto que las ADNligasas toleran una variedad de malos emparejamientos del sustrato de ácido nucleico. Por ejemplo, T4 ADNligasa tiene una tolerancia de malos emparejamientos que resulta en una propensión para sellar una de cada 103 dobles hélices mal emparejadas. Showalter, A. K., et al., 106 Chem. Rev, 340-360 (2006) . En comparación, la tasa de error de una ADNpolimerasa convencional es aproximadamente un error por cada 105-106 inserciones dNTP, varios órdenes de magnitud más altos en fidelidad que la ligasa. Otras reacciones de enlace atípicas de la ADNligasa incluyen la formación de enlaces intermoleculares (Western, L., et al., 19 Nucleic Acids Res, 809-813 (1991) ) , uniones de dobles hélices de extremo no afilado que no se solapan (Barringer, K., et al., 89 Gene, 117-122 (1990) , Cao, W., 22 Trends Biotechnol., 38-44 (2004) ) y reacciones independientes a el molde (Barringer, K., et al., Kuhn, H., et al., 272 FEBS J, 5991-6000 (2005) ) .

Se han descrito varios enfoques para mejorar la fidelidad de ADN ligadura. Por ejemplo, Luo, J., et al., 24 Nucleic Acids Res, 3079-3085 (1996) publica modificar el tercer nucleótido anterior a partir de 3’-OH, un aceptor con base universal 3-nitropirrol y una mutagénesis dirigida al sitio de la proteína ligasa. Tong, J., et al., 27 Nucleic Acids Res, 788-794 (1999) ; Feng, H., et al., 43 Biochemistr y , 12648-12659 (2004) ; Jeon, H., et al., 237 FEMS Microbiol Lett., 111-118 (2004) ; Lim, J., et al., 388 Arch Biochem Biophys., 253-260 (2001) ; y Luo, J., et al., 24 Nucleic Acids Res, 3071-3078 (1996) publican residuos de amino ácido mutando en la ADNligasa. Cao, W., 22 Trends Biotechnol., 38-44 (2004) publica utilizar una endonucleasa en la reacción de ligadura. Egholm, M., et al., Patente Estadounidense Núm. 6, 297, 016 publica modificaciones de aceptor. Fung, S., et al., Patente Estadounidense Núm. 5, 593, 826 publica sondas de aceptor substituido 3’-NH2. Bandaru, R., et al., patentes estadounidenses nums. 6, 811, 986 y 6, 635, 425 publican el uso de 5’-tiofosfatos en la hebra del dador (5’-fosfato) .

Los cofactores de ligasa modificados se han utilizado para determinar la dependencia del cofactor de ligasa y como inhibidores de ligadura. Véase p.ej., Montecucco, A., et al., 271 Biochem J., 265-268 (1990) ; Shuman, S., 34 Biochemistr y , 16138-16147 (1995) ; Raae, A., et al., 81 Biochem. Biophys. Res. Commun., 24-27 (1978) ; Cherepanov, A.V., et al., 269 Eur. J. Biochem., 5993-5999 (2002) ; Belford, H.G., et al., 268 J Biol Chem, 2444-2450 (1993) ; Doherty, A.J., et al., 271 J Biol Chem, 11083-11089 (1996) ; Ho, C.K., et al., 71 J Virol, 19311937 (1997) ; Lai, X., et al., 6

M. Zirvi et al. (Nucleic Acid Research 27:e41-47, 1999) estudió la fidelidad de las ligasas termoestables para la detección de secuencia repetida de microsatélite utilizando secuencias de oligonucleótido que contienen análogos a las bases nitrogenadas.

J. Luo et al. (Nucleic Acid Research 24:3071-3078, 1996) publica el desarrollo de un ensayo cuantitativo para medir la fidelidad de la Tth ADN ligasa utilizando sustratos marcados con fluorescentes. Esta investigación descubrió que la enzima muestra una discriminación mayor contra todos los malos emparejamientos de base única del lado 3’ de la mella en comparación con aquellas del lado 5’ de la mella. La investigación destacó que la fidelidad de la enzima podría ser mejorada adicionalmente introduciendo una base mal emparejada o un análogo a la base nitrogenada universal (Q) en la tercera posición del oligonucleótido discriminante.

Zirvi et al. y Luo et al. demuestran mejoras en la fidelidad de ADNligasa que son, en el mejor de los casos, 100 veces mejores (desde 4.5x102 hasta 4, 2x104) según se describe en Luo et al., indicando que no existe espacio para que la mejora alcance la fidelidad de las ADN polimerasas.

Shuman (Biochemistr y 34 (49) : 16138-16147, 1995) publica la especificidad, fidelidad e inhibición de la ADN ligasa vaccinia virus. Esta investigación descubrió que la vacuna ligasa catalizaba la hebra eficiente uniendo el ADN con mellas (rupturas del enlace entre dos nucleótidos vecinos) en presencia de magnesio y ATP. Extremophiles, 469-477 (2002) ; y Sriskanda, V., et al., 28 Nucleic Acids Res, 2221-2228 (2000) .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Aquí se proporcionan métodos y composiciones para la ligadura de ácido nucleico. Estos métodos incluyen el uso de ligasa de ácido nucleico, sustratos de ácido nucleico, cofactores, dadores o aceptores de ligasa, en reacciones de ligadura del ácido nucleico. En ciertos aspectos, los métodos se obtienen utilizando cofactores de ligasa modificados, dadores modificados, aceptores modificados o combinaciones de los mismos (denominados colectivamente aquí como “componentes de ligasa modificados”) , que proporcionan una fidelidad mejorada en la ligadura de ácido nucleico. En modos de realización preferidos, los cofactores de ligasa modificados son ATP modificado y NAD+ modificado.

De acuerdo con un aspecto, se proporcionan métodos para detectar una mutación en un ácido nucleico diana. En ciertos modos de realización de los aspectos aquí proporcionados, el método incluye incubar el ácido nucleico diana en una mezcla de reacción que incluye una ligasa de ácido nucleico dependiente de un cofactor, un cofactor de ligasa, un polinucleótido dador y un polinucleótido aceptor, donde uno o más de entre el cofactor de ligasa, polinucleótido dador y polinucleótido aceptor están modificados; y para supervisar la ligadura de los polinucleótidos dador y aceptor, donde la cantidad de ligadura es indicativa de la presencia o ausencia de la mutación.

En un segundo aspecto, se proporcionan métodos para detectar la presencia o ausencia de una de las bases alternativas en un sitio de polimorfismo de un único nucleótido (SNP) en un ácido nucleico diana.... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para detectar una mutación en un ácido nucleico diana, dicho método comprendiendo: incubar dicho ácido nucleico diana en una mezcla de reacción comprendiendo una ligasa de ácido nucleico dependiente de un cofactor, un cofactor de ligasa ATP modificado, un polinucleótido dador y un polinucleótido aceptor, en el que uno o más de dichos cofactores de ligasa ATP, polinucleótido dador y polinucleótido aceptor están modificados; y supervisar la ligadura de los polinucleótidos dador y aceptor, donde la cantidad de ligadura es indicativa de la presencia o la ausencia de la mutación y donde la presencia del cofactor de ligasa ATP modificado mejora la especificidad de ligadura en relación con el cofactor de ligasa ATP no modificado correspondiente.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polinucleótido dador tiene la fórmul.

5. fosfato-X (n1) -Y (n2) -Z (n3) -3' y el polinucleótido aceptor tiene la fórmul.

5. D (n4) -E (n5) -F (n6) -hidroxi-3', donde (n2) , (n3) , (n4) y (n5) son cada uno independientemente 0 o cualquier entero positivo, donde (n1) y (n6) son cada uno independientemente 0, 1, 2, 3 o 4, donde X, Z, D y F son posiciones de nucleótidos complementarios al ácido nucleico diana, donde al menos uno de entre Y o E es una posición de nucleótido de interés.

3. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, donde la presencia de un cofactor de ligasa ATP

modificado reduce o inhibe la ligadura del ácido nucleico no complementario en relación con la ligadura 20 del ácido nucleico complementario.

4. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde la presencia de un cofactor de ligasa ATP modificado, un aceptor modificado o un dador modificado aumenta la especificidad de ligadura cuando tanto el extremo 3’ del aceptor como el extremo 5’ de dador están emparejados al ácido nucleico diana en comparación con cuando el extremo 3’ del aceptor o el extremo 5’ del dador comprende un nucleótido mal emparejado en relación con el ácido nucleico diana.

5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, donde la presencia de un cofactor de ligasa ATP modificado, un aceptor modificado o un dador modificado inhibe o reduce la ligadura de un ácido nucleico mal emparejado; y tiene al menos aproximadamente la misma eficacia de ligadura del ácido nucleico emparejado en comparación con un cofactor, aceptor o dador no modificado.

6. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde existe al menos un par de bases mal emparejado en 10 bases en cada lado de la unión de ligadura. 35

7. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde la ligasa es una ADN ligasa o una ARN ligasa dependiente de un molde.

8. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde la ligadura comprende uno o

más métodos de ligadura enzimática seleccionados del grupo que consiste en: ensayo por ligadura de oligonucleótidos (OLA) , reacción en cadena por ligasa (LCR) , PCR mediada por ligasa (LM-PCR) , reacción PCR de detección de ligadura (PCR-LDR) , sondas candado (Padlock) , ensayo de ligadura de oligonicleótidos PCR (PCR-OLA) , técnica LCR tipo Gap, SNPlex, MLPA (amplificación múltiple de sonda dependiente de las ligaduras) , ensayo de genotipado GoldenGate y ensayo por sonda de inversión 45 molecular, ligadura de proximidad y secuenciación de nueva generación mediante ligadura.

9. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde al menos un cofactor de ligasa ATP modificado tiene la estructura de la fórmula IA:

123 4

donde: W, W, Wy Wse selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en N, CR1, y N+R1;

cada R1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, OR2, SR2, SeR2 , NR2R3, N3, C (Y) R4, alquil, alquenil, alquinil, aril y aralquil sustituidos o no sustituidos, donde cualquier

sustituyente puede cada uno contener opcionalmente uno o más heteroátomos;

5 Z1 se selecciona del grupo que consiste en H, F, R2, OR2, SR2, SeR2, NR2R3, NR2OR2, NR2-NR2R3 , CN, N3, (BH3) -M+ y C (Y) R4 ;

M+ es un catión;

10 cada R2 y cada R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H o alquil, alquenil,

alquinil, aril y aralquil sustituidos o no sustituidos, donde cualquier sustituyente puede cada uno

contener opcionalmente uno o más heteroátomos;

cada R4 se selecciona del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, OR2, SR2, SeR2, NR2R3, C (Y) R2 y

15 alquil, alquenil, alquinil, aril y aralquil sustituidos o no sustituidos, donde cualquier sustituyente puede

cada uno contener opcionalmente uno o más heteroátomos;

cada Y se selecciona del grupo que consiste en O, S, Se, CR1R1 y NR1 ; y

20 X1, X2, X3 y X4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en R1, NR2OR2, NR2 -NR2R3, CN, N3, NO, NO2, NCO, NCS, OCN, SCN y SSR2 .

10. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde el cofactor de ligasa ATP

modificado se selecciona del grupo que consiste en 7-deaza-adenosina-5'-trifosfato, 7-deaza-2'

25 deoxiadenosina-5'-trifosfato, 7-metil-7-deaza-adenosina-5'-trifosfato, 7-metil-7-deaza-2'-deoxiadenosina

5'-trifosfato, N1-metil-adenosina-5'-trifosfato, N1-metil-2'-deoxiadenosina-5'-trifosfato, 8-cloro-adenosina

5'-trifosfato, 8-cloro-2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, 8-aza-adenosina-5'-trifosfato, 8-aza-2'-deoxi

adenosina-5'-trifosfato, 8-azido-adenosina-5'-trifosfato, 8-azido-2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, N6-metil

adenosina-5'-trifosfato, N6-metil-2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, 2-Cloropurina-2'-deoxiribosida-5'

30 trifosfato, 2-aminopurine-2'-deoxiribosida-5'-trifosfato, inosina-5'-trifosfato.

2. deoxi-inosina-5'-trifosfato,

2-amino-adenosina-5'-trifosfato, 2-amino-2'-deoxiadenosina-5'-trifosfato, 2-amino-3'-deoxiadenosina-5%

trifosfato, 2-amino-2', 3'-dideoxiadenosina-5'-trifosfato.

5. alfa-thio-adenosina-5'-trifosfato.

5. alfa-thio-2'

deoxiadenosina-5'-trifosfato.

5. alfa-thio-3'-deoxiadenosina-5'-trifosfato.

5. alfa-thio-2', 3'

dideoxiadenosina-5'-trifosfato.

5. alfa-[P-borano]-adenosina-5'-trifosfato, .

5. alfa-[P-borano]-2'

35 deoxiadenosina-5'-trifosfato.

5. alfa-[P-borano]-3'-deoxiadenosina-5'-trifosfato.

5. alfa-[P-borano]-2', 3'

dideoxiadenosina-5'-trifosfato.

5. alfa-metilfosfonate-adenosina-5'-trifosfato.

5. alfa-metilfosfonate-2'

deoxiadenosina-5'-trifosfato.

5. alfa-metilfosfonate-3'-deoxiadenosina-5'-trifosfato.

5. alfa-metilfosfonate

2', 3'-dideoxiadenosina-5'-trifosfato.

5. alfa-fenilfosfonato-adenosina-5'-trifosfato.

5. alfa-fenilfosfonato-2'

deoxiadenosina-5'-trifosfato.

5. alfa-fenilfosfonato-3'-deoxiadenosina-5'-trifosfato.

5. alfa-fenilfosfonato

40 2', 3'-dideoxiadenosina-5'-trifosfato.

3. amino-3'-deoxi-adeuosine-5'-trifosfato.

3. amino-2', 3'-dideoxi

adenosina-5'-trifosfato, 2-amino-2-deoxi-adenosina-5'-trifosfato.

2. amino-2', 3'-dideoxi-adenosina-5'

trifosfato.

3. azido-3'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, 3-azido-2', 3'-dideoxi-adenosina-5'-trifosfato, 2-azido

2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato.

2. azido-2', 3'-dideoxi-adenosina-5'-trifosfato.

3. fluoro-3-deoxi

adenosina-5'-trifosfato.

3. fluoro-2', 3'-dideoxi-adenosina-5'-trifosfato.

2. fluoro-2-deoxi-adenosina-5'

45 trifosfato.

2. uoro-2', 3'-dideoxi-adenosina-5'-trifosfato.

2. deoxi-adenosina-5'-trifosfato.

3. deoxi

adenosina-5'-trifosfato, 2', 3'-dideoxi-adenosina-5'-trifosfato, 2-ara-adenosina-5'-trifosfato.

3. metil-3'

deoxiadenosina-5'-trifosfato.

3. metil-2', 3'-dideoxiadenosina-5'-trifosfato.

3. thio-3'-deoxiadenosina-5'

trifosfato.

3. thio-2', 3'-dideoxiadenosina-5'-trifosfato.

3. metilamino-3'-deoxi adenosina-5'-trifosfato, 3'

metilamino-2', 3'-dideoxi adenosina-5'-trifosfato, 3-metoxi-3'-deoxi-2-amino-adenosina-5'-trifosfato, 3'

50 metoxi-2', 3'-dideoxi-2'-amino-adenosina-5'-trifosfato, 2-metoxi-2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato.

2. metoxi

2', 3'-dideoxi-adenosina-5'-trifosfato.

3. metoxi-3'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato.

3. metoxi-2', 3'-dideoxi

adenosina-5'-trifosfato.

2. metoxi-2'-deoxi-2-amino-adenosina-5'-trifosfato, .

2. metoxi-2', 3'-dideoxi-2

amino-adenosina-5'-trifosfato.

55 11. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, comprendiendo además al menos un

aceptor modificado añadido a la reacción de ligadura.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, para la detección de una mutación en un ácido

nucleico diana, dicho método comprendiendo: incubar dicho ácido nucleico diana en un mezcla de

60 reacción comprendiendo una ligasa de ácido nucleico dependiente de un cofactor, un cofactor de ligasa

ATP, un polinucleótido dador y un polinucleótido aceptor modificado, donde el al menos un aceptor

modificado tiene la estructura de la Fórmula II:

donde: cada B1, B2 y B3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en una purina o una pirimidina sustituida o no sustituida, cualquier derivado aza o deaza de las mismas y cualquier “base universal” o “base degenerada”, que es preferiblemente reconocible por una polimerasa o ligasa de ácido nucleico;

cada X1 y X2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en OH, SH, CH3 y OCH2CH3;

cada Y1, Y2 e Y3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, F, OH, and OCH3; y W se selecciona de H o un residuo oligonucleótido,

y supervisar la ligadura de los polinucleótidos dador y aceptor, donde la cantidad de ligadura es indicativa de la presencia o ausencia de la mutación. 15

13. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, comprendiendo además al menos un dador modificado añadido a la reacción de ligadura.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, para detectar una mutación en un ácido nucleico diana,

dicho método comprendiendo incubar dicho ácido nucleico diana en una mezcla de reacción comprendiendo una ligasa de ácido nucleico dependiente de un cofactor, un cofactor de ATP ligasa, un polinucleótido dador modificado y un polinucleótido aceptor, donde el al menos un dador modificado tiene la estructura de la Fórmula III:

donde:

3

cada B, By Bse selecciona independientemente del grupo que consiste en purina o pirimidina sustituida o no sustituida, cualquier derivado aza o deaza de las mismas y cualquier “base universal” o

“base degenerada”, que es preferiblemente reconocible mediante una polimerasa o ligasa de ácido nucleico;

cada X1 y X2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en OH, SH, CH3 y OCH2CH3; 5 cada Y1, Y2 e Y3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, OH y OCH3; y

W se selecciona de H o un residuo oligonucleótido,

y supervisar la ligadura de los polinucleótidos dador y aceptor, donde la cantidad de ligadura es indicativa de la presencia o ausencia de la mutación.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, comprendiendo además al menos un dador modificado añadido a la reacción de ligadura. 15

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 14, comprendiendo además al menos un dador modificado añadido a la reacción de ligadura.

17. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde el cofactor de ATP ligasa

modificado se selecciona del grupo que consiste e.

2. deoxi-adenosina-5'-trifosfato.

3. deoxi-adenosina-5'trifosfato.

2. metoxi-2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato.

2. amino-2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato.

2. azido-2'deoxi-adenosina-5'-trifosfato.

2. fluoro-2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato.

2. metoxi-2'-deoxi-2-aminoadenosina-5'-trifosfato, 2', 3'-dideoxi-adenosina-5'-trifosfato, 2-amino-2'-deoxiadenosina-5'-trifosfato, 8chloro-2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, N6-metil-2'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato, 7-deaza-2'

deoxiadenosina-5'-trifosfato, 2-Chloropurine-2'-deoxiribosida-5'-trifosfato y 2-aminopurine-2'-deoxiribosida5'-trifosfato.

18. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde el cofactor de ATP ligasa modificado se selecciona del grupo que consiste e.

3. amino-2', 3'-dideoxi-adenosina-5'-trifosfato.

3. azido

3'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato.

3. fluoro-3'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato.

3. fluoro-2', 3'-dideoxi-adenosina5'-trifosfato.

3. metoxi-3'-deoxi-adenosina-5'-trifosfato an.

2. amino-2', 3'-dideoxi-adenosina-5'-trifosfato.

Dibujos