Cepa hospedante bacteriana que comprende un gen spr mutante y que tiene actividad reducida de Tsp.

Una celula bacteriana Gram negative recombinante que comprende un gen spr mutante

, que codifica una proteina spr UniprotKB/SwissProt P0AFV4, que tiene una mutaciOn en uno o mas aminoacidos seleccionada de N31Y, R62C, 170T, Q73R, C94A, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D, V135G, L136P, G140C, R144C, H145A, G147C y H157A, y en donde la celula tiene actividad reducida de la proteina Tsp, proteasa especifica de la cola, comparada con una celula de tipo natural.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2011/050413.

Solicitante: UCB Biopharma SPRL.

Nacionalidad solicitante: Bélgica.

Dirección: ALLÉE DE LA RECHERCHE 60 1070 BRUSSELS BELGICA.

Inventor/es: HUMPHREYS, DAVID, PAUL, ELLIS,MARK.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/70 (Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a E. coli)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/245 (Escherichia (G))

PDF original: ES-2539931_T3.pdf

 

google+ twitter facebook

Fragmento de la descripción:

Cepa hospedante bacteriana que comprende un gen spr mutante y que tiene actividad reducida de Tsp

La invención se refiere a una cepa hospedante bacteriana recombinante, en particular E. coli. La invención también se refiere a un método para producir una proteína de interés en dicha célula.

Antecedentes de la invención Las células bacterianas, tales como E. coli, se usan habitualmente para producir proteínas recombinantes. Hay muchas ventajas en el uso de células bacterianas, tales como E. coli, para producir proteínas recombinantes, en particular debido a la naturaleza versátil de las células bacterianas como células hospedantes que permiten la inserción de genes mediante plásmidos. E. coli se ha usado para producir muchas proteínas recombinantes, incluyendo insulina humana.

A pesar de las muchas ventajas del uso de células bacterianas para producir proteínas recombinantes, todavía hay limitaciones significativas, que incluyen la dificultad de producir proteínas sensibles a proteasas. Las proteasas tienen una función importante en la renovación de proteínas viejas, dañadas o mal plegadas en el periplasma y citoplasma de E. coli. Las proteasas bacterianas actúan para degradar la proteína recombinante de interés, reduciendo así a menudo significativamente el rendimiento de la proteína activa.

Se han identificado una serie de proteasas bacterianas. En E. coli se han identificado proteasas, que incluyen Proteasa 111 (ptr) , DegP, OmpT, Tsp, prlC, ptrA, ptrB, pepA-T, tsh, espc, eatA, c1pP e Ion.

La Tsp (también conocida como Prc) es una proteasa periplásmica de 60 kDa. El primer sustrato conocido de la Tsp fue la proteína de unión a penicilina 3 (PBP3) ("Determination of the c1eavage site involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3 of Escherichia coli"; Nagasawa H, Sakagami Y, Suzuki A, Suzuki H, Hara H, Hirota Y. J Bacterio/. 1989 Nov; 171 (11 ) :5890-3 y "Cloning, mapping and characterization of the Escherichia coli Tsp gene which is involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3"; Hara H, Yamamoto Y, Higashitani A, Suzuki H, Nishimura Y. J Bacterio/. 1991 Aug;173 (15) :4799-813) , pero más tarde se descubrió que la Tsp también podía escindir las proteínas de la cola del fago, y por lo tanto, se renombró como proteasa específica de cola (Tsp, por sus siglas en inglés Tail Specific Protease) (Silber et al., Proc. Nat!. Acad. Sci. USA, 89: 295-299 (1992) ) . Silber et al. ("Deletion of the prc (tsp) gene provides evidence for additionaUail-specific proteolytic activity in Escherichia coli K12"; Silber, K.R., Sauer, R.T.; Mo/ Gen Genet 1994242:237-240) describe una cepa de eliminación de prc (KS1000) en donde la mutación se creó sustituyendo un segmento del gen prc por un fragmento que comprendía un marcador Kanr.

La reducción de la actividad de la Tsp (prc) es deseable para reducir la proteolisis de proteínas de interés. Sin embargo, se ha encontrado que las células que carecen de la proteasa prc presentan crecimiento termosensible a osmolalidad baja. Hara et al., aislaron revertientes termorresistentes que contenían mutaciones supresoras (spr) extragénicas (Hara et al., Microbia/Drug Resistance, 2: 63-72 (1996) ) . Spr es una proteasa periplásmica unida a membrana de 18 kDa y los sustratos de la spr son Tsp y peptidoglicanos en la membrana extema implicados en la hidrólisis de la pared celular durante la división celular. El gen de spr se denomina UniProtKB/SwissProt POAFV4 (SPR_ECOLl) .

Se han descrito cepas deficientes en proteasa mejoradas que comprenden el gen spr mutante. Chen et al. describen la construcción de cepas de E. coli que llevan diferentes combinaciones de mutaciones en prc (Tsp) y otra proteasa, DegP, creadas por amplificación de regiones en la dirección 5' y la dirección 3' del gen y ligándolas entre sí en un vector que comprende marcadores de selección y una mutación sprW174R ("High-Ievel accumulation ot a recombinant antibody fragment in the periplasm of Escherichia coli requires a triple-mutant (t.DegP t.prc sprW174R) host strain" (Chen C, Snedecor B, Nishihara JC, Joly JC, McFarland N, Andersen DC, Battersby JE, Champion KM. Biotechno/ Bioeng. 2004 Mar 5;85 (5) :463-74) . Se encontró que la combinación de las mutaciones t.DegP, t.prc y sprW174R proporcionaba los niveles mayores de cadena ligera de anticuerpo, cadena pesada de anticuerpo y F (ab') 2-LZ. El documento EP1341899 describe una cepa de E. coli que es deficiente en DegP y prc cromosómicos que codifican proteasas DegP y Prc, respectivamente, y albergan un gen spr mutante que codifica un proteína que suprime fenotipos de crecimiento presentados por cepas que albergan mutantes de prc.

La presente invención proporciona nuevas cepas bacterianas que llevan mutantes de spr alternativos que proporcionan medios ventajosos para producir proteínas recombinantes.

Resumen de la invención En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una célula bacteriana Gram negativa recombinante que comprende un gen spr mutante que codifica una proteína spr que tiene una mutación en uno o más aminoácidos seleccionados de N31, R62, 170, 073, C94, S95, \/98, 099, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144, H145, G147 y H157, yen donde la célula tiene actividad reducida de la proteína Tsp comparada con una célula de tipo natural.

En una realización, el genoma de la célula es isogénico con una célula bacteriana de tipo natural excepto por el gen spr mutado y la modificación requerida para reducir la actividad de la proteína Tsp comparada con una célula de tipo natural.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una célula bacteriana Gram negativa recombinante que tiene actividad reducida de la proteína Tsp comparada con una célula de tipo natural y que comprende un gen spr mutante que codifica la proteína spr, en donde el genoma de la célula es isogénico con una célula bacteriana de tipo natural excepto por la modificación requerida para reducir la actividad de la proteína Tsp comparada con una célula de tipo natural y el gen spr mutado.

Las células proporcionadas por el primer y segundo aspectos de la presente invención muestra fenotipos de producción de proteínas y crecimiento ventajosos.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una proteína de interés que comprende expresar la proteína de interés en una célula bacteriana Gram negativa recombinante como se ha definido antes. .

Breve descripción de los dibujos La figura 1 muestra el perfil de crecimiento de cepas MXE008 y MXE009 que expresan Fab' anti-TNFa comparado con cepas W311 Ode tipo natural y MXE001 que expresan Fab' anti-TNFa.

La figura 2 muestra la expresión de Fab' antiTNFa de MXE008 y MXE009 comparado con W3110 de tipo natural y MXE001.

La figura 3 muestra el perfil de crecimiento de cepas MXE008 y MXE009 que expresan Fab' anti-TNFa comparado con cepas W311 Oy MXE001de control que expresan Fab' anti-TNFa.

La figura 4 muestra el rendimiento de Fab' anti-TNFa del periplasma (símbolos sombreados) y el líquido sobrenadante (símbolos en blanco) de cepas de E. coli MXE008 y MXE009 comparado con W3110 y MXE001de control.

La figura 5 muestra el perfil de crecimiento de cepas MXE0012 y MXE017 que expresan Fab' anti-TNFa comparado con cepas W3110 y MXE001de tipo natural que expresan Fab' anti-TNFa.

La figura 6 muestra la expresión de Fab' anti-TNFa en MXE012 y MXE017 comparado con W311 Ode tipo natural y MXE001.

La figura 7 muestra el perfil de crecimiento de W311 O, MXE001 y MXE008 durante una fermentación de producción de Fab' anti-TNFa.

La figura 8 muestra la acumulación periplásmica de Fab' anti-TNFa (líneas y símbolos negros)... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una célula bacteriana Gram negativa recombinante que comprende un gen spr mutante, que codifica una proteína spr UniprotKB/SwissProt POAFV4, que tiene una mutación en uno o más aminoácidos seleccionada de N31Y, R62C, 170T, 073R, C94A, S95F, V98E, 099P, R100G, L 108S, Y115F, D133A, V135D, V135G, L 136P, G140C, R144C, H145A, G147C y H157A, yen donde la célula tiene actividad reducida de la proteína Tsp, proteasa específica de la cola, comparada con una célula de tipo natural.

2. Una célula según la reivindicación 1, en donde el gen spr mutante codifica una proteína spr que tiene las mutaciones S95F y Y115F.

3. Una célula según las reivindicaciones 1 o 2, en donde la célula comprende además uno o más de los siguientes genes mutados:

a) un gen DegP mutado que codifica una proteína DegP que tiene actividad de chaperona y actividad reducida de proteasa;

b) un gen ptr mutado, en donde el gen ptr codifica una proteína proteasa 111 que tiene actividad reducida de proteasa o es un gen ptr mutado inactivado; y

c) un gen OmpT mutado, en donde el gen OmpT mutado codifica una proteína OmpT que tiene actividad reducida de proteasa o es un gen OmpT mutado inactivado.

4. Una célula según la reivindicación 1, 2 o 3, en donde la célula Comprende un gen Tsp mutado, proteasa específica de la cola, que codifica una proteína Tsp que tiene actividad reducida de proteasa o es un gen Tsp

mutado inactivado.

5. Una célula según la reivindicación 4, en donde el genoma de la célula es isogénico con una célula bacteriana de tipo natural excepto por el gen spr mutado y el gen Tsp mutado.

6. Una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el célula tiene un gen Tsp mutado inactivado, que comprende una mutación en el codón de inicio del gen y/o uno o más codones de parada situados en la dirección 3' del codón de inicio del gen y en la dirección 5' del codón de parada del gen.

7. Una célula según la reivindicación 6, en donde el gen Tsp mutado inactivado comprende un sitio de restricción marcador creado por una mutación de aminoácido en el codón de inicio del gen y opcionalmente una o más mutaciones puntuales.

8. Una célula según la reivindicación 7, en donde el gen Tsp mutado inactivado comprende la SEO ID NO: 3.

9. Una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la célula es E. coli.

10. Una célula según cualquier reivindicación precedente, en donde la célula comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una proteína de interés.

11. Una célula según la reivindicación 10, en donde la proteína de interés es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo.

12. Una célula según la reivindicación 11, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es especifico para el TNF.

13. Un método para producir una proteína de interés que comprende cultivar una célula bacteriana Gram negativa recombinante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en un medio de cultivo en condiciones eficaces para expresar la proteína recombinante de interés y recuperar la proteína recombinante de interés del periplasma de la célula bacteriana Gram negativa recombinante y/o del medio de cultivo.

14. Un método según la reivindicación 13, en donde el método comprende además recuperar la proteína de interés de la célula.

15. Un método según la reivindicación 14, en donde la proteína de interés se recupera del periplasma y/o del líquido sobrenadante.