La determinación de la función tímica en el adulto ha cobrado creciente interés en el contexto de las enfermedades del sistema inmunológico,

y especialmente en aquellas enfermedades que producen linfopenias.

El objeto de la presente invención lo constituye un conjunto de cebadores para la determinación de la funcionalidad del timo humano mediante el cálculo del cociente entre el contenido de los TREC, así como un procedimiento basado en PCR multiplex anidada que utiliza los mencionados cebadores y que permite la determinación del cociente TRECs medido en muestras de tejidos o sangre humanos.

La presente invención aporta, frente a los procedimientos conocidos del estado de la técnica, ventajas en lo relativo a reducción de errores experimentales así como en términos de ahorro de tiempo y costes

Cebadores, procedimiento y conjunto de útiles para la determinación de la funcionalidad del timo humano.

Objeto de la invención

La determinación de la función tímica en el adulto ha cobrado creciente interés en el contexto de las enfermedades del sistema inmunológico, y especialmente en aquellas enfermedades que producen linfopenias. La presente invención aporta, frente a los procedimientos conocidos del estado de la técnica, ventajas en lo relativo a reducción de errores experimentales así como en términos de ahorro de tiempo y costes.

Constituye un primer objeto de la presente invención un conjunto de cebadores para la determinación de la funcionalidad del timo humano mediante el cálculo del cociente entre el contenido de TREC (T-cell rearrangement excisión circle) de tipo delta y beta.

Constituye un segundo objeto de la presente invención un procedimiento basado en PCR multiplex anidada que utiliza los mencionados cebadores y que permite la determinación del cociente TRECs medido en muestras de tejidos o sangre humanos, particularmente en el timo y en sangre periférica, parámetro que constituye un indicador de la funcionalidad del timo por su correlación directa con el porcentaje de timocitos dobles positivos.

Constituye un último objeto de la presente invención un conjunto de útiles para la puesta en práctica de dicho procedimiento basado en PCR multiplex anidada.

Estado de la técnica

Durante la generación de los linfocitos T (LT), las cadenas alfa y beta que forman el receptor clonotípico del LT (T-Cell Receptor, o TCR), se generan por recombinación al azar de segmentos génicos de tipo V, D y J. Durante esta recombinación, el ADN que los separa es eliminado del cromosoma en forma de círculo, formando los denominados TRECs (T-cell rearrangement excision circle). Estos TRECs son fragmentos de ADN de existencia independiente al cromosoma, por lo que carecen de orígenes de replicación. Cuando la célula que los porta prolifera, el TREC no se replica y es conservado por solo una de las células generadas. Debido a que el único modo de generar TRECs es mediante los mecanismos de reordenación génica que ocurren en el timo, se les ha considerado como marcadores moleculares de la función tímica.

Existen centenares de TRECs diferentes, tantos como posibilidades de recombinación compatible entre los segmentos génicos V, D y J de las cadenas del TCR. De todos ellos, se conoce particularmente uno que por sus características de formación es extremadamente frecuente entre los LT que abandonan el timo, es el llamado TREC dRec-?Ja, o más comúnmente signal-joint TREC o delta TREC (Douek et al. "Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection"; Nature 1998, Vol. 396, 690-695). Tradicionalmente se han usado los TRECs delta como marcadores de función tímica, encontrándose numerosas publicaciones que los usan, la mayoría de ellas en el contexto de la infección por VIH o en el transplante de médula ósea en pacientes inmunosuprimidos.

Sin embargo, muchas de estas publicaciones señalan una limitación de la técnica para medir la función tímica, especialmente en el caso de la infección por VIH [Hazemberg et al. "Increased cell division but not thymic dysfunction rapidly affects the T-cell receptor excision circle content of the naive T cell population in HIV- 1 infection" 2000 Nature Medicine Vol. 6 (8) 1036- 1042] Aunque el número absoluto de TRECs no puede aumentar de forma independiente del timo, la frecuencia de células portadoras en sangre periférica si puede cambiar por proliferación y/o apoptosis de los LT maduros. Estos parámetros están aumentados en la infección por el VIH, y pueden disminuir con el tratamiento antirretroviral. Estos cambios pueden aumentar la frecuencia de células portadoras de TRECs sin que haya aumento de función tímica, simplemente debido a la reducción de LT activados, carentes de TRECs (células diluyentes).

Recientemente se ha publicado una variación de la técnica que salva esta dificultad: se determina el cociente entre dos tipos de TRECs: los tradicionalmente medidos delta y los TRECs beta (Dion et al. HIV Infection Rapidly Induces and Maintains a Substancial Suppression of Thymocyte Proliferation; 2004 Immunity, Vol. 21, 757-768), en base al siguiente modelo: la generación en el timo de un LT implica el paso ordenado por diferentes estadios de diferenciación que se caracterizan por la expresión secuencial de marcadores de superficie que definen las poblaciones triple negativa (TN, CD3^- CD4^- CD8^-), doble positiva (DP, CD4⁺CD8⁺) y simple positiva (SP, CD3⁺CD4⁺ o CD3⁺CD8⁺) así como por la secuencia siguiente: reordenación de la cadena beta, fase de proliferación celular y reordenamiento de la cadena alfa. Tras la reordenación productiva de la cadena beta durante la fase de TN todas las células poseen TRECs beta como subproducto de dicha hbox{reordenación, y comienzan entonces una fase de proliferación y transformación en células DP.}

Esta expansión permite aumentar el número de células con reordenamientos productivos del TCR beta, pero tienen como consecuencia la dilución del número de TRECs beta en dicha población de timocitos. A continuación, y durante el proceso de reordenación de la cadena alfa se genera el TREC delta, fijándose en este punto el cociente de TRECs delta/beta, cociente que caracterizará a la cohorte de LT que saldrán posteriormente del timo.

La hipótesis del artículo de Dion establece que el grado de proliferación entre los estadios TN y DP es variable y que se puede estimar analizando el cociente en los LT exportados del timo. Podemos suponer que existe una relación directa entre el grado de proliferación intratimica y el total de células exportadas por el timo (Almeida et al. T Cell Homeostasis: Thymus Regeneration and Peripheral T Cell Restoration in Mice with a Reduced Fraction of Competent Precursors. 2001. Journal of Experimental Medicine, Vol 194, 591-599) y que este cociente no es alterado por expansión periférica de los LT. Se ha probado esta relación estableciendo una correlación directa entre el porcentaje de timocitos DP en el timo como hbox{indicativo de su funcionalidad, y el cociente de TRECs medido en el timo y/o en la sangre periférica.}

El problema de esta nueva aproximación es que a diferencia del TREC delta, que es único, existen hasta trece posibilidades de recombinación diferentes para generar TRECs beta, lo que requiere determinar individualmente cada posible TREC por separado y sumar los valores parciales. La técnica propuesta por Dion mide diez de los trece TRECs beta, cada uno mediante una PCR cuantitativa independiente. A continuación se suman todos para obtener el total de TRECs beta de la muestra. Según la técnica originalmente descrita, para determinar el cociente entre el TRECs delta y la suma de los TRECs beta se necesitan 11 PCRs convencionales y 55 PCR en tiempo real por muestra (realizando las medidas por triplicado). Con la presente aproximación por PCR multiplex, seis de los trece TRECs beta son coamplifícados simultáneamente, y reamplificados junto con los TRECs delta en una nueva reacción multiplex en el mismo tubo de PCR. De este modo para determinar el cociente de una muestra (también por triplicado), solo se necesitan seis PCR convencionales y tres en tiempo real.

Explicación de la invención

Constituye un primer objeto de la presente invención un conjunto de cebadores para la determinación de la funcionalidad del timo humano mediante el cálculo del cociente entre el contenido de TREC de tipo delta y beta; dicho conjunto incluye al menos tres cebadores que presentan cada uno de ellos una secuencia de nucleótidos que es complementaria con alguna región comprendida entre los nucleótidos 187957 a 190719 de la secuencia depositada en la base de datos del Genbank con número de acceso U66061, así como una secuencia de nucleótidos en su extremo 5' que es sustancialmente no complementaria con ninguna región conocida del genoma humano. Preferentemente, los cebadores que conforman el conjunto presentan en su extremo 3' una misma secuencia común a todos ellos que es o bien idéntica, o bien complementaria, a alguna de las secuencias SEQ. ID. 01 a SEQ. ID. 99 (ver tablas 1 y 2) y más preferentemente la secuencia común a todos los cebadores en su extremo 3' es la SEQ. ID. 07. Adicionalmente, el conjunto de cebadores incluye al menos un cebador que contiene alguna de las secuencias SEQ. ID. 100 a SEQ. ID. 112, y preferentemente...

1. Conjunto de cebadores para la determinación de la funcionalidad del timo humano mediante el cálculo del cociente entre el contenido de TREC de tipo delta y beta, caracterizado porque dicho conjunto incluye al menos tres cebadores que presentan cada uno de ellos una secuencia de nucleótidos que es complementaria con alguna región comprendida entre los nucleótidos 187957 a 190719 de la secuencia depositada en la base de datos del Genbank con número de acceso U66061, así como una secuencia de nucleótidos en su extremo 5' que es sustancialmente no complementaria con ninguna región conocida del genoma humano.

2. Conjunto de cebadores para la determinación de la funcionalidad del timo humano según la reivindicación 1, caracterizado porque los cebadores de dicho conjunto presentan en su extremo 3' una misma secuencia común a todos ellos, que es o bien idéntica, a bien complementaria, a alguna de las secuencias SEQ. ID. 01 a SEQ. ID. 99.

3. Conjunto de cebadores para la determinación de la funcionalidad del timo humano según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque dichos cebadores presentan en su extremo 3' la secuencia SEQ. ID. 07.

4. Conjunto de cebadores para la determinación de la funcionalidad del timo humano según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho conjunto incluye alguna de las secuencias SEQ. ID. 100 a SEQ. ID. 112.

5. Conjunto de cebadores para la determinación de la funcionalidad del timo humano según la reivindicación 4, caracterizado porque dicho conjunto de cebadores está formado por:

6. Procedimiento para la determinación de la funcionalidad del timo humano que incluye etapas de amplificación simultánea de más de un TREC de tipo beta o de tipo delta mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR multiplex), caracterizado porque dicho procedimiento comprende:

7. Procedimiento para la determinación de la funcionalidad del timo humano según la reivindicación 6, caracterizado porque las alícuotas de los productos de amplificación de las primeras reacciones de amplificación son usadas directamente o diluidas al menos en proporción 1:2, preferentemente 1:20.

8. Procedimiento para la determinación de la funcionalidad del timo humano según las reivindicaciones 6 y 7, caracterizado porque la detección de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa del conjunto de TREC delta y beta se realiza en tiempo real mediante una sonda de hibridación común para todos los TREC beta y una sonda de hibridación específica para el TREC delta, siendo distinguibles las señales de ambas sondas.

9. Procedimiento para la determinación de la funcionalidad del timo humano según las reivindicaciones 6-8, caracterizado porque la detección de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa del conjunto de TREC delta y beta se realiza mediante sondas de fluorescencia.

10. Procedimiento para la determinación de la funcionalidad del timo humano según las reivindicaciones 6 a 9 caracterizado porque los cebadores utilizados se corresponden con las secuencias SEQ. ID. 100 a SEQ. ID. 112, realizándose según las siguientes etapas:

11. Procedimiento para la determinación de la funcionalidad del timo humano según las reivindicaciones 6 a 10, caracterizado porque en cada reacción PCR y en paralelo a las muestras problema se amplifica una dilución seriada de una recta patrón que contiene concentraciones conocidas de los productos de la primera reacción de amplificación del d-TREC o de los ß-TREC, de forma que se pueda comparar con los valores obtenidos con las muestras problema en el ciclo umbral de amplificación de la segunda PCR en tiempo real, obteniéndose las concentraciones a partir de la interpolación de los ciclos umbral de cada muestra problema con el ajuste logarítmico-lineal del ciclo umbral de la recta patrón.

12. Procedimiento para la determinación de la funcionalidad del timo humano según las reivindicaciones 6 a 11, caracterizado porque el número absoluto de copias de d-TREC o ß-TRECs por microlitro de preparación de ADN celular se normaliza a partir del número de copias del gen de la betaglobina, con dos copias de dicho gen por célula, expresándose la frecuencia de dichos TRECs como número de círculos por millón de células totales.

13. Conjunto de útiles para la determinación de la funcionalidad del timo humano mediante un procedimiento según las reivindicaciones 6 a 12, caracterizado porque incluye:

14. Conjunto de útiles para la determinación de la funcionalidad del timo humano según la reivindicación 13, caracterizado porque las sondas de hibridación que permiten la diferenciación entre los ß-TRECs y el d-TREC son sondas de fluorescencia.