Un método para el análisis de metilación de ácido nucleico.

Un método para el análisis de la metilación de un ácido nucleico bicatenario

, que comprende convertir dicho ácido nucleico de forma tal que la 5-metilcitosina permanece sin cambio, mientras que la citosina no metilada se convierte a uracilo o a otra base que se distingue de la citosina en su comportamiento de apareamiento de base, dicha reacción lleva a dos hebras de ácidos nucleicos convertidas diferentes que ya no son complementarias entre sí, analizar ambas hebras de ácidos nucleicos convertidas en una reacción de detección para la presencia o ausencia de metilación de CpG en la misma posición, en donde

a) se analiza la presencia de metilación en una o más posiciones CpG de una hebra convertida y la ausencia de metilación en la misma o más posiciones CpG de la otra hebra convertida; o

b) se analiza la presencia o ausencia de metilación en la misma o más posiciones CpG de ambas hebras convertidas.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2007/006810.

Solicitante: EPIGENOMICS AG.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: Geneststrasse 5 10829 Berlin ALEMANIA.

Inventor/es: TETZNER,REIMO, LEWIN,Jörn.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)

PDF original: ES-2538214_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Un método para el análisis de metllaclón de ácido nucleico Campo de la invención

La invención se refiere generalmente a métodos nuevos y sustancialmente mejorados para el análisis de metilación de ácido nucleico sensible. Particularmente se refiere a la detección sensible y/o cuantitativa específica de posiciones metiladas o no metiladas.

Antecedentes de aspectos de la invención

Se conoce bien en la técnica que el ADN así como el ARN pueden metilarse. La base 5-metilcitosina es la base modificada covalentemente más frecuente encontrada en el ADN de las células eucarióticas. La metilación del ADN juega un importante papel biológico en, por ejemplo, la regulación de la transcripción, la impronta genética, y la tumorigénesis (para revisión ver, por ejemplo, Millar y otros: Five not four: History and significance of the fifth base; en The Epigenome, S. Beck and A. Olek (eds.), Wiley-VCH Publishers, Weinheim 23, págs. 3-2). La identificación de la 5-metilcitosina es de particular interés en el área del diagnóstico del cáncer. Pero la identificación de la metilación es difícil. La citosina y la 5-metilcitosina tienen el mismo comportamiento de apareamiento de base, lo que hace a la 5- metilcitosina difícil de detectar por medio del uso de métodos particulares estándar. Los métodos de análisis de ADN convencionales basados en hibridación, por ejemplo, no son aplicables. Adicionalmente, la información de la metilación se pierde completamente por la amplificación por medio de PCR.

Por consiguiente, los métodos actuales para el análisis de la metilación de ADN se basan en dos enfoques diferentes. El primer enfoque usa enzimas de restricción específicas de metilación para distinguir el ADN metilado, en base al clivaje del ADN específico de metilación. El segundo enfoque comprende la conversión química selectiva (por ejemplo, tratamiento con bisulfito; ver por ejemplo documento WO 25/3851) de citosinas no metiladas a uracilo mientras las citosinas metiladas permanecen sin cambio. El uracilo tiene el mismo comportamiento de apareamiento de bases que la timina. Por lo tanto forma pares de bases con la adenina. En su lugar, la 5-metilcitosina híbrida con guanina aún después del tratamiento con bisulfito. Es con ello posible diferenciar entre citosinas metiladas y no metiladas. El ADN pretratado enzimáticamente o químicamente generado en estos enfoques típicamente se pre-amplifica y analiza en diferentes formas (ver, por ejemplo, documento WO 2/7288 págs. 1 ff; Fraga y Estella: DNA methylation: a profile of methods and applications; Biotechniques, 33:632,634,636-49,22). La pre-amplificación del ADN pretratado químicamente conduce a un aumento de la sensibilidad de la reacción de detección posterior.

Diferentes métodos de PCR se conocen en la técnica para analizar las posiciones de citosina convertida y no convertida. La amplificación selectiva sólo de posiciones de citosina no convertida (metilada) o con el enfoque inverso, convertida (no metilada) se logra por medio del uso de iniciadores específicos de metilación en los presuntos métodos de PCR específicos de metilación (MSP), o por medio del uso de 'bloqueadores' en los métodos "HeavyMethyl" (ver, por ejemplo, Hermán y otros.: Methylation specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Nati Acad Sci USA. 93:9821-6, 1996; Cottrell y otros: A real-time PCR assay for DNA-methylation using methylation specific blockers. Nucí. Acids Res., 32:e1, 24). Por otra parte, es posible amplificar el ADN en una manera específica por no metilación, y analizar los amplificados por medio de sondas específicas de metilación (ver, por ejemplo, Trinh y otros: DNA methylation analysis by MethyLight technology.Methods, 25:456-62, 21). Métodos especiales basados en PCR además se aplican como variantes de PCR 'en tiempo real', lo que hace posible detectar el estado de metilación directamente en el curso de la PCR, sin necesidad de un análisis posterior de los productos (MethyLight; documento WO /79; Estados Unidos 6,331,393; y Trinh y otros 21, supra).

La cuantificación del grado de metilación del ADN se requiere en muchas aplicaciones que incluyen, pero sin limitarse a, clasificación de tumores, obtención de información pronostica, o para predecir efectos/respuestas al fármaco. Diferentes métodos para tal cuantificación se conocen en la técnica, tales como 'análisis de punto final' y 'análisis del valor umbral'.

Análisis de punto final: En alguna medida, el ADN se pre-amplifica, como por ejemplo en el método Ms-SNuPE, para la hibridación en microensayos, para ensayos de hibridación en solución o para secuenciación con bisulfito directa (ver, por ejemplo, Fraga y Estella 22, supra). Un problema con tal "análisis de punto final" (donde la cantidad del amplificado se determina al final de la amplificación) es que la amplificación puede ocurrir de manera no uniforme debido a, entre otros, obstrucción del producto, inestabilidad de la enzima y/o una disminución en la concentración de los componentes de la reacción. La correlación entre la cantidad de amplificado, y la cantidad de ADN utilizado es, por lo tanto, no siempre adecuada, y la cuantificación es así sensible a error (ver, por ejemplo, Kains: The PCR plateau phase - towards an understanding of its limitations. Binchem. Biophys. Acta 1494:23-27,2).

Análisis de valor umbral: Por contraste, el análisis de valor umbral, que se basa en una PCR en tiempo real, determina la cantidad de amplificado en la fase exponencial de la amplificación, en vez de al final de la amplificación. Tales

métodos umbral , tiempo real, suponen que la eficiencia de amplificación es constante en la fase exponencial. El valor umbral reconocido de la técnica Ct es una medida correspondiente, dentro de una reacción de PCR, al primer ciclo de PCR en que la señal en la fase exponencial de la amplificación es mayor que la señal de fondo. La cuantificación absoluta después se determina por medio de una comparación del valor Ct del ADN investigado (prueba) con el valor Ct de un estándar (ver, por ejemplo, Trlnh y otros 21, supra; Lehmann y otros: Quantitative assessment of promoter hypermethylatlon durlng breast cáncer development. Am J Pathol., 16:65 -12, 22). Un problema sustancial de tal análisis basado en el valor Ct es que cuando se usan altas concentraciones de ADN, sólo se puede lograr una pequeña resolución. Este problema además se aplica cuando se determinan altos grados de metilación a través de los valores de PMR (para la discusión de los valores de PMR ver, por.ejemplo., Eads y otros, CANCER RESEARCH 61:341-3418, 21.) Además, las amplificaciones de un gen de referencia (por ejemplo, el de la p-actina) se requiere además para este tipo de análisis de Ct (ver, por ejemplo, Trlnh y otros 21, supra). (Una visión general de la PCR en tiempo real basada en la cuantificación puede obtenerse dedocumento WO 25/9835; Real-Time PCR: An Essential Guide, Horizon Bioscience, Kirstin Edwards, Julie Logan and Nick Saunders, May 24 ISBN: -9545232-7X; Real-time PCR, M. Tevfik Dorak, Taylor & Francis, abril 26), ISBN: 41537734X; Mackay IM, Arden KE, Nitsche A. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res. 22 Mar 15;3(6):1292-35;Bernard PS, Wittwer CT. Real-time PCR technology for cáncer diagnostics. Clin Chem. 22 ago;48(8): 1178-85; Bernhard Kaltenboeck and Chengming Wang. Advances in real-time PCR: Application to clinical laboratory diagnostics. Advances in Clinical Cáncer, 25; 4:219-259).

Un parámetro crítico para el análisis de metilación es la sensibilidad. La razón para esto es el problema de que las muestras a analizar por lo general comprenden ADN heterogéneo. El ADN es de la misma secuencia pero tiene una metilación diferente. De ese modo, ADN con un buscado... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para el análisis de la metilación de un ácido nucleico bicatenario, que comprende convertir dicho ácido nucleico de forma tal que la 5-metilcitosina permanece sin cambio, mientras que la citosina no metilada se convierte a uracilo o a otra base que se distingue de la citosina en su comportamiento de apareamiento de base, dicha reacción lleva a dos hebras de ácidos nucleicos convertidas diferentes que ya no son complementarias entre sí, analizar ambas hebras de ácidos nucleicos convertidas en una reacción de detección para la presencia o ausencia de metilación de CpG en la misma posición, en donde

a) se analiza la presencia de metilación en una o más posiciones CpG de una hebra convertida y la ausencia de metilación en la misma o más posiciones CpG de la otra hebra convertida; o

b) se analiza la presencia o ausencia de metilación en la misma o más posiciones CpG de ambas hebras convertidas.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la conversión del ácido nucleico comprende un reactivo químico, tal como bisulfito, o una enzima, tal como citidina-deaminasa.

3. El método de la reivindicación 1, en donde analizar ambas hebras de ácidos nucleicos convertidas comprende el análisis de las secciones solapada, adyacentes o diferentes correspondientes de las hebras del ácido nucleico proporcionado originalmente

4. El método de la reivindicación 1, en donde analizar ambas hebras de ácidos nucleicos convertidas comprende

a) la cuantificación de la metilación o la no- metilación de una o más posiciones CpG; y

b) la cuantificación del ácido nucleico convertido; o la cuantificación de los ácidos nucleicos no convertidos.

5. El método de la reivindicación 1, en donde, analizar ambas hebras de ácidos nucleicos convertidas comprende al menos uno seleccionado del grupo que comprende: método de amplificación, método de PCR, método de amplificación isotérmico, método NASBA , método LCR , método de amplificación específico de metilación, método MSP (PCR específica de metilación) , método MSP anidado, método HeavyMethyl, método de detección, método de detección específico de metilación, método de secuenciación con bisulfito, detección por medio de microarreglos, detección por medio de microarreglos de oligonucleótido, detección por medio de enzimas de restricción, métodos de amplificación y detección simultáneos específicos de metilación, PCR en tiempo real, método de PCR en tiempo real HeavyMethyl, método MSP MethyLight, método MethyLight, método MethyLight Algo , método QM , método Headloop MethyLight, método HeavyMethyl MethyLight, método HeavyMethylScorpion , método MSP Scorpion, método Headloop Scorpion , extensión del iniciador sensible a la metilación, y método Ms-SNuPE (extensión del iniciador de un solo nucleótido sensible a la metilación).

6. El método de la reivindicación 5, en donde analizar ambas hebras convertidas comprende el análisis de cada hebra convertida por una reacción del mismo método.

7. El método de la reivindicación 5, en donde analizar ambas hebras convertidas comprende el análisis de una hebra convertida por una reacción de un método y el análisis de la otra hebra convertida por una reacción de un método diferente.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el ADN genómico se analiza por PCR en tiempo real.

9. Un método para el diagnóstico del cáncer, que comprende el uso del método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para determinar el estado de metilación de una posición CpG del gen TMEFF2 y/o una región regulatoria del mismo, en donde la presencia de la metilación en CpG es indicativa de la presencia de cáncer.