Ácido nucleico que comprende: (a) las secuencias de un virus de la gastroenteritis transmisible competente para la replicación (TGEV),

codificando dichas secuencias para una replicasa de TGEV bajo el control de secuencias reguladoras de la expresión, en el que la replicasa es expresada en una célula huésped e iniciará la replicación del ácido nucleico y aumentará así el número de ácidos nucleicos en la célula; y (b) una secuencia que codifica para por lo menos un epítopo neutralizante de ORF5 del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), incluyendo dicha secuencia un residuo de formación de puente disulfuro; y (c) una secuencia que codifica para por lo menos un polipéptido adicional que puede aumentar una respuesta inmunitaria contra el PRRSV, en el que se ha modificado la secuencia que codifica para dicho epítopo neutralizante de ORF 5 para desactivar los sitios de glicosilación que interfieren en la inducción de anticuerpos

La presente invención se refiere a ácidos nucleicos que comprenden: secuencias de un virus de la gastroenteritis transmisible competente para la replicación (TGEV) y una secuencia que codifica para por lo menos un epítopo neutralizante de ORF5 del virus del 5 síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), incluyendo dicha secuencia un residuo de formación de puente disulfuro y habiéndose modificado para desactivar los sitios de glicosilación que interfieren en la inducción de anticuerpos.

La presente invención se refiere además a vectores, células huésped y partículas 10 virales que comprenden estas secuencias así como a la utilización de las secuencias para la preparación de composiciones farmacéuticas en general y específicamente para la preparación de vacunas con eficacia mejorada.

15

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

Los enfoques de terapia que implican la inserción de un gen funcional en una célula para lograr un efecto terapéutico también se denominan enfoques de terapia génica, dado que el gen actúa como fármaco. La terapia génica es una técnica 20 principalmente para corregir los genes defectuosos responsables del desarrollo de enfermedades.

Se utiliza una molécula portadora también denominada vector para suministrar el gen terapéutico a las células diana del paciente. En la actualidad, el vector más común es 25 un virus que se ha alterado genéticamente para portar genes humanos o animales. Los virus han desarrollado un modo de encapsular y suministrar sus genes a células humanas o animales de una manera patógena. Los científicos han aprovechado esta capacidad y manipulan el genoma del virus para eliminar los genes causantes de enfermedades e insertan genes terapéuticos. 30

Estos vectores virales se utilizaron para expresar genes heterólogos que provocan una respuesta inmunógena en el sujeto que recibe el vector y así inmunizar a ese sujeto. En ese caso el vector viral actúa como vacuna.

35

El virus de la gastroenteritis transmisible es un miembro de la familia de los coronavirus. Los coronavirus son virus de ARNss(+) que presentan el genoma más grande encontrado hasta el momento en los virus de ARN con una longitud de entre 25 y 31 kilobases kb (véase SIDDELL S.G. 1995, The Coronaviridae). Cuando un coronavirus infecta una célula, el ARN genómico (ARNg) se replica en el citoplasma y se produce un 40 conjunto de ARN subgenómicos (ARNsg) de polaridad positiva y negativa (SETHNA et al., 1989; SAWICKI & SAWICKI , 1990; y VAN DER MOST y SPAAN, 1995).

Debido al hecho de que los coronavirus se replican en el citoplasma, se ha sugerido la utilización de los coronavirus como vector para terapia génica y vacunación 45 (ENJUANES et al., 2003). Específicamente, se produjeron genomas de interferencia defectuosa (DI) de coronavirus. Estos genomas DI son mutantes de deleción que requieren la presencia de un virus de complementación o auxiliar para la replicación y/o transcripción (véase CHANG et al., 1994; documento WO97/34008; solicitud de patente española P9600620; IZETA et al., 1999; SÁNCHEZ et al., 1999).

Se clonó todo el genoma de un coronavirus en forma de un ADNc infeccioso (ALMAZAN et al., 2000 y el documento WO01/39797). La clonación de todo el genoma 5 permitió la preparación de vectores infecciosos que contienen secuencias heterólogas adecuadas para la expresión de proteínas grandes en una célula huésped. El documento WO01/39797 y PLANA-DURBAN - et al., 2003 (Int. Symposium on Emerging and Re-Emerging Pig Diseases, 2003, páginas 115-116) también sugieren expresar las secuencias de PRRSV a partir del vector de ADNc infeccioso de coronavirus. 10

El potencial del genoma viral clonado para la expresión de secuencias heterólogas se revisó en ENJUANES et al., 2003.

Utilizando el virus clonado, se evaluaron la estructura del genoma y la relevancia 15 de los genes coronavirales para la infección preparando mutantes de deleción. Se encontró que los genes 3a, 3b y 7 no son esenciales para la replicación del ácido nucleico viral y que la ausencia de los genes reduce la patogenicidad del virus (ORTEGO et al., 2002 y 2003; SOLA et al., 2003).

20

El virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) se identificó por primera vez en 1991 como el agente causante de una nueva enfermedad en los cerdos (WENSVOORT et al., 1991). Desde entonces, el PRRSV se ha convertido en una de las causas principales de pérdidas económicas en explotaciones porcinas en todo el mundo y en la actualidad se acepta como la enfermedad infecciosa más importante del cerdo, que 25 provoca fallos en la reproducción en animales adultos y neumonía grave en cerdos neonatos. El PRRSV es un miembro de la familia Arteriviridae que pertenece al orden de los Nidovirales. Se reconocen dos genotipos (americano y europeo) (MURTAUGH et al., 1995). El PRRSV es un virus encapsulado con un genoma de ARN de sentido positivo monocatenario de 14,5 Kb. Los dos tercios en el sentido de 5' del genoma codifican para 30 las poliproteínas de replicasa (ppla y pplab), el resto del ARN genómico codifica para tres glicoproteínas asociadas a la membrana secundarias (Gp2, Gp3 y Gp4) y las tres proteínas estructurales principales (Gp5, M y N). Generalmente los cerdos se infectan con PRRSV tras la exposición de la superficie de la mucosa o las vías respiratorias al virus. Un distintivo de la respuesta de los anticuerpos porcinos contra PRRSV son los anticuerpos 35 no neutralizantes abundantes detectados de manera temprana en la infección, seguido de un título bajo de anticuerpos neutralizantes que aparece más de 3 semanas tras la infección. En los últimos años se han recogido datos experimentales que muestran la importancia de los anticuerpos neutralizantes en la protección contra la infección por PRRSV (LOPEZ y OSORIO, 2004, ANSARI et al., 2006). La glicoproteína Gp5 de PRRSV 40 contiene la mayoría de los epítopos neutralizantes del virus. Las proteínas Gp4 y M de PRRSV también inducen anticuerpos neutralizantes, sin embargo, los anticuerpos específicos para Gp5 neutralizan más eficazmente PRRSV que los que se unen a otras proteínas virales (OSTROWSKI et al., 2002). La infección por PRRSV también induce unas respuestas inmunitarias mediadas por células T más débiles y retardadas en relación 45 con las provocadas por otros virus. Ambas respuestas se requieren para completar el aclaramiento de virus.

Se ha observado que las proteínas ORF5 de PRRSV son portadoras de cadenas de polilactosaminoglicano, sin embargo, en ese momento se desconocía la relevancia de estas cadenas para la neutralización de anticuerpos (CHEN et al., Virology, vol. 266, 2000, páginas 88-98).

Aunque la respuesta inmunitaria frente a PRRSV se entiende muy poco, se están 5 comercializando algunas vacunas. Las vacunas actuales contra PRRSV presentan varios inconvenientes. El PRRSV, ya sea de tipo natural o atenuado, induce un nivel bajo de inmunidad mediada por células (MEIER et al., 2003) y los anticuerpos neutralizantes (NA) no se desarrollan hasta una fase tardía de la infección (MEIER et al., 2003, VEZINA et al., 1996, YOON et al., 1995). Además, se cree que la diversidad genética del PRRSV influye 10 en la eficacia de la vacuna en las condiciones de campo (LABARQUE et al., 2004, PESCH et al., 2005), aunque existe cierto grado de protección cruzada (MENGELING et al., 2003 a, 2003b). Las vacunas vivas modificadas protegen contra la exposición a aislados homólogos, pero generalmente presentan un efecto limitado contra la exposición a virus heterólogos (MENG, 2000). Además, las vacunas vivas proporcionan protección parcial 15 contra la enfermedad clínica, pero no prevenían la infección (OSORIO et al., 1998) y, de manera más importante, pueden revertir a virulencia (BONER et al., 1997, NIELSEN et al., 2001). Por otra parte, las vacunas de PRRSV destruido, han demostrado ser menos eficaces en la prevención tanto de infección como de enfermedad (OSTROWSKI et al., 2002). 20

El problema que subyace a la presente invención consiste por tanto en proporcionar vectores de vacuna eficaces con buena seguridad e inmunogenicidad contra PRRSV.

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SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Según...

1. Ácido nucleico que comprende:

5

(a) las secuencias de un virus de la gastroenteritis transmisible competente para la replicación (TGEV), codificando dichas secuencias para una replicasa de TGEV bajo el control de secuencias reguladoras de la expresión, en el que la replicasa es expresada en una célula huésped e iniciará la replicación del ácido nucleico y aumentará así el número de 10 ácidos nucleicos en la célula; y

(b) una secuencia que codifica para por lo menos un epítopo neutralizante de ORF5 del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), incluyendo dicha secuencia un residuo de formación de puente 15 disulfuro; y

(c) una secuencia que codifica para por lo menos un polipéptido adicional que puede aumentar una respuesta inmunitaria contra el PRRSV,

20

en el que se ha modificado la secuencia que codifica para dicho epítopo neutralizante de ORF 5 para desactivar los sitios de glicosilación que interfieren en la inducción de anticuerpos.

25

2. Ácido nucleico según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico codifica para una replicasa de TGEV y una secuencia que codifica para la proteína N de TGEV.

3. Ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2, en el que el vector de TGEV 30 competente para la replicación no es infeccioso.

4. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el vector de TGEV competente para la replicación es infeccioso. 35

5. Ácido nucleico según la reivindicación 4, en el que el ácido nucleico comprende además uno o más de los genes de TGEV siguientes: S, E, M y/o N.

40

6. Ácido nucleico según la reivindicación 4 ó 5, en el que las partículas virales infecciosas de TGEV que pueden obtenerse de la asociación de las proteínas de TGEV y las secuencias de ácido nucleico son partículas virales atenuadas.

45

7. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el gen S se deriva de un virus respiratorio.

8. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el gen S deriva de una cepa intestinal de TGEV.

5

9. Ácido nucleico según la reivindicación 5, en el que se ha modificado el gen S y presenta la SEC ID nº: 1.

10. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la 10 secuencia comprende un epítopo neutralizante de ORF5 y por lo menos un epítopo de ORF 6 de PRRSV.

11. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la 15 secuencia comprende un epítopo neutralizante de ORF5 y un epítopo neutralizante de ORF 6 de PRRSV.

12. Ácido nucleico según la reivindicación 10, en el que la secuencia está 20 constituida por un epítopo neutralizante de ORF5 y la totalidad del ORF 6 de PRRSV.

13. Ácido nucleico según la reivindicación 11, en el que la secuencia está constituida por un epítopo neutralizante de ORF5 y un epítopo neutralizante de ORF 6 de 25 PRRSV.

14. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el ácido nucleico comprende las secuencias de ORF5 y ORF6 de PRRSV cada una bajo el 30 control de una secuencia reguladora de la expresión separada.

15. Ácido nucleico según reivindicación 14, en el que la secuencia está constituida por (1) la secuencia de ORF5 de PRRSV bajo el control de la secuencia reguladora de la 35 transcripción del gen 3a, (2) la secuencia de ORF6 de PRRSV bajo el control de la secuencia reguladora de la transcripción TRS22N expuesta como SEC ID nº: 19 y (3) la secuencia del gen S derivado de la cepa atenuada PTV de TGEV.

40

16. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el ácido nucleico codifica además para la señal de direccionamiento lisosómico de la proteína II integral de membrana lisosómica (LIMPII).

45

17. Ácido nucleico según la reivindicación 16, en el que dicho ácido nucleico codifica para una proteína de fusión constituida por LIMPII y ORF5 y/u ORF6 de PRRSV.

18. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el ácido nucleico codifica además para la subunidad p35 de IL-12 u otras interleucinas.

19. ARN recombinante codificado por un ácido nucleico según cualquiera de las 5 reivindicaciones 1 a 18.

20. Vector que comprende un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 19. 10

21. Vector según la reivindicación 20, en el que el vector un vector de ADNc.

15

22. Vector según la reivindicación 21, en el que el vector es un vector BAC-TGEVFL.

23. Vector según la reivindicación 22, en el que el vector BAC-TGEVFL contiene la 20 secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 17 ó 18.

24. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en el que el vector puede replicar el ácido nucleico dentro de una célula huésped. 25

25. Célula huésped que comprende un vector según una de las reivindicaciones 20 a 24.

30

26. Célula huésped según la reivindicación 25, en la que la célula es una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula animal o una célula humana.

35

27. Célula huésped según la reivindicación 26, en la que la célula es una línea celular porcina de testículo de cerdo, tal como la línea celular depositada como ATCC CRL-1746.

40

28. Partícula de virus que comprende un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y por lo menos una proteína de la cubierta de TGEV.

45

29. Partícula de virus según la reivindicación 28, que comprende todas las proteínas de la cubierta de TGEV de la partícula de virus de TGEV natural.

30. Preparación farmacéutica que comprende un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 18, un ARN viral o un vector según una de las reivindicaciones 19 a 24 o una célula huésped según una de las reivindicaciones 25 a 27 o una partícula de virus según la reivindicación 28 ó 29.

5

31. Preparación farmacéutica según la reivindicación 30, que comprende además un vehículo, excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

10

32. Vacuna que puede proteger un animal contra PRRSV que comprende un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 18, un ARN o vector viral según una de las reivindicaciones 19 a 24, una célula huésped según una de las reivindicaciones 25 a 27 o una partícula de virus según la reivindicación 28 ó 29.

15

33. Vacuna según la reivindicación 31, en el que la vacuna es una vacuna multivalente que puede proporcionar protección contra uno o varios patógenos de cerdo distintos de PRRSV.

20

34. Vacuna según la reivindicación 33, que comprende además los antígenos derivados de otras proteínas y/o patógenos virales y/o bacterianos que proporcionarán inmunidad contra los patógenos.

25

35. Vacuna según la reivindicación 33 ó 34, que comprende además uno o varios antígenos derivados de otros patógenos virales seleccionados de virus de la gripe porcina, parvovirus porcino, circovirus porcino de tipo 2, peste porcina clásica, peste porcina africana, glosopeda, virus de seudorrabia, circovirus porcino de tipo 1, adenovirus 30 porcinos, enterovirus porcinos, coronavirus respiratorio porcino, rotavirus porcino, virus de encefalomiocarditis, virus de la diarrea epidémica porcina, virus de la enfermedad del ojo azul, virus de la hepatitis E y/o virus del Nilo Occidental, virus Nipah.

35

36. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, que comprende además uno o varios antígenos derivados de otros patógenos virales seleccionados de entre virus de la gripe porcina, parvovirus porcino, circovirus porcino de tipo 2, peste porcina clásica, peste porcina africana y/o glosopeda.

40

37. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, que comprende además uno o varios antígenos derivados de patógenos bacterianos seleccionados de entre Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida tipo A (toxinas), Pasteurella multocida tipo D 45 (toxinas), Bordetella bronchiseptica, Isospora suis, Brachyspira hyodysenteriae, Brachyspira pilosicoli, Lawsonia intracellularis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Escherichia coli, Salmonella enterica, Mycoplasma hyorinis, Streptococcus suis, Clostridium

perfringens, Clostridium difficile, Clostridium novyi, Brucella abortus y/o Candidatus helicobacter suis.

38. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, que comprende 5 además uno o varios antígenos derivados de patógenos bacterianos seleccionados de entre Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida tipo A (toxinas), Pasteurella multocida tipo D (toxinas), Bordetella bronchiseptica, Isospora suis, Brachyspira hyodysenteriae, Brachyspira pilosicoli, Lawsonia intracellularis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Escherichia 10 coli y/o Salmonella enterica.

39. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 38, en la que el antígeno viral o bacteriano adicional está presente en la vacuna multivalente como un virus o 15 bacteria atenuado o inactivado o como una secuencia de ácido nucleico que codifica para uno o varios de los antígenos virales o bacterianos adicionales.

40. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 39, que comprende 20 además las secuencias de ácido nucleico que codifican para las proteínas que conferirán protección contra los patógenos de cerdo, tales como las secuencias de ácido nucleico que codifican para uno o varios anticuerpos que presentan especificidad para las enfermedades bacterianas o virales o las secuencias de ácido nucleico que codifican para la proteína priónica porcina. 25

41. Vacuna según una de las reivindicaciones 32 a 40 que comprende además un vehículo, excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

30

42. Vacuna según una de las reivindicaciones 32 a 41, en la que la vacuna resulta apropiada para vacunar un cerdo, preferentemente una cerda.

35

43. Vacuna según una de las reivindicaciones 32 a 41, en la que la vacuna puede inducir tanto una respuesta inmunitaria sistémica como una respuesta inmunitaria de la mucosa contra los agentes virales infecciosos.

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