Método para la producción de partículas de vector poliomavírico recombinante.

Método para la producción de partículas de vector poliomavírico recombinante que no codifiquen un antígeno T pequeño poliomavírico funcional,

que comprende las etapas de:

a. Proporcionar una estirpe celular permisiva para poliomavirus natural, comprendiendo dicha estirpe celular un gen codificador de un antígeno T grande poliomavírico funcional integrado de manera estable en el genoma de la célula, en el que la estirpe celular no comprende un gen codificador de un antígeno T pequeño poliomavírico funcional,

b. Introducir en dicha estirpe celular un ADN de poliomavirus que no codifique un antígeno T pequeño poliomavírico funcional y que tampoco codifique un antígeno T grande funcional,

c. Cultivar dichas células en un medio de crecimiento en condiciones en las que la estirpe celular produzca el antígeno T grande en trans y que permita la formación de partículas de vector poliomavírico recombinante y

d. Recoger las partículas de vector poliomavírico recombinante del cultivo celular.

Método para la producción de partículas de vector poliomavírico recombinante.

Campo de la invención

La presente descripción se refiere a métodos mejorados para la producción de partículas víricas, vectores víricos y partículas de vectores víricos. En particular, la descripción proporciona métodos mejorados para la producción de partículas de vector poliomavírico recombinante y estirpes celulares productoras de vector poliomavírico. Más en particular, la descripción proporciona métodos para la producción de vectores poliomavíricos de simio tales como vectores víricos de virus de los simios 40 (SV40). La descripción también se refiere a composiciones que comprenden vectores víricos y usa los mismos y partículas de vector vírico para tratar trastornos genéticos, rechazo de trasplantes, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades infecciosas, alergias o cáncer.

Antecedentes de la invención

A lo largo de la última década, se ha dedicado mucho esfuerzo al desarrollo de las tecnologías de suministro de genes o ácidos nucleicos eficaces para la introducción y expresión apropiada de genes o ácidos nucleicos en células diana. Se pueden usar genes o ácidos nucleicos terapéuticos para restituir genes con funcionamiento inadecuado para tratar trastornos genéticos, para inducir una respuesta inmunitaria para tratar cáncer y enfermedades infecciosas o suprimir una respuesta inmunitaria, por ej., induciendo/restituyendo la tolerancia inmunitaria para evitar el rechazo de trasplantes o para tratar enfermedades autoinmunitarias y alergias. Los genes o ácidos nucleicos terapéuticos se pueden administrar como moléculas desnudas o como ácidos nucleicos empaquetados en compuestos lipidíeos y/o proteínicos.

Puesto que los virus evolucionan para suministrar y expresar su información genética en sus células diana huésped, se han explorado vectores víricos como vehículos de suministro de genes y se encontró que son con diferencia los medios más eficaces para suministrar información genética a una célula viva. Se ha desarrollado y ensayado una serie de sistemas de suministro de genes de vectores víricos en ensayos preclínicos y clínicos. Estos ensayos revelaron que los vectores usados en la actualidad, que proceden de adenovirus, poxvirus, herpesvirus, alfavirus, retrovirus, parvovirus y poliomavirus, son en general seguros de usar y eficaces en el suministro de genes terapéuticos a células diana.

Una desventaja principal de los vectores de suministro de genes víricos usados en la actualidad es el hecho de que no se pueden producir en suficientes cantidades para tratar números significativos de pacientes. La mayoría de los vectores víricos es producida por transinfección de células productoras con ADN de plásmido que codifica el vector y los componentes del vector. Esto en general proporciona 1 a 10 millones de partículas de vector por mililitro de volumen de cultivo celular. En ensayos clínicos, en general, se tienen que administrar 1 x 1010 a 1 x 1012 partículas de vector a un paciente para conseguir efectos clínicos beneficiosos. Esto significa que para tratar 1.000 pacientes, se requiere más de 1 millón de litros de cultivo celular para proporcionar suficientes cantidades de partículas de vector.

Además, los ensayos preclínicos y clínicos revelaron que la mayoría de los vectores de suministro de genes víricos ensayados tales como vectores adenovírico, poxvírico, herpesvírico, alfavírico y retrovírico inducen una fuerte respuesta inmunitaria en pacientes, dirigida a componentes de vectores víricos y los productos génicos terapéuticos. Como consecuencia, estos vectores sólo se pueden administrar una sola vez a un paciente, mientras que los niveles de expresión de los genes terapéuticos introducidos decrecen rápidamente. Los vectores víricos procedentes de virus adeno-asociados (AAV, por sus siglas en inglés) no inducen respuestas inmunitarias en animales y son inmunológicamente inertes. Sin embargo, la mayoría de la población humana encontró AAV natural junto con su virus auxiliar, por ej., adenovirus y como resultado desarrolló una fuerte memoria CTL frente a las proteínas de la cápside de AAV. Como consecuencia, las células transducidas de AAV se retiran fácilmente y los niveles de expresión del gen o ácido nucleico terapéutico introducido por un vector vírico de AAV decrecen rápidamente.

Los rendimientos de proteínas recombinantes producidas en células de mamífero comparado con aquéllas producidas en células procariotas son bajos en general, a pesar del uso de fuertes activadores y/o inserciones de transgenes multicopia u otras maneras de mejorar la transcripción. Se han usado vectores competentes de replicación vírica o replicones durante mucho tiempo como sistemas de expresión para la producción de proteínas recombinantes en células de mamífero. El gen diana en dichos vectores se puede expresar bajo control transcripcional de activadores víricos según lo cual los ARNm deseados se pueden acumular a niveles extremadamente altos en el citoplasma pronto después de transinfección, proporcionando grandes cantidades de proteína diana.

La patente internacional WO 2005/024030 describe el uso de un antígeno T grande poliomavírico en un sistema de expresión de proteínas basado en células de roedores.

Hasta ahora, los éxitos con los sistemas de expresión basados en replicones han sido limitados. Los sistemas de replicones basados en virus de ARN en general producen proteínas recombinantes durante sólo un periodo de tiempo breve, mientras que los derivados de virus de ADN en general no se replican bien en las estirpes celulares

usadas comercialmente.

Hasta donde sabemos, sólo hay un vector de suministro de genes vírico que es inmunológicamente inerte en los seres humanos y que se puede producir en cantidades suficientes para tratar un número significativo de pacientes. Por otra parte, se puede emplear este vector de suministro de genes vírico como un sistema de replicones para la producción de proteínas recombinantes en estirpes celulares de mamíferos. Este sistema de vector vírico procede de virus de los simios 40 (SV40), un poliomavirus de simios.

Los poliomavirus están constituidos por una familia de virus de ADN no de envoltura con cápsides icosahédricas. Se aíslan de una variedad de especies animales incluyendo seres humanos, monos, roedores y pájaros. Se han descrito cinco poliomavirus humanos, denominados poliomavirus BK, JC, WU, Kl y de Células de Merkel. Se han descrito muchos poliomavirus de mono de los cuales el más conocido es SV40. SV40 se replica deficientemente en células humanas y las infecciones en seres humanos son raras. Las infecciones por SV40 ocasionales tienen lugar por transmisión del virus de monos a personas que viven en estrecho contacto con estos animales o por vacunación con lotes de partículas de poliovirus inactivadas contaminadas con SV40.

SV40 presenta un genoma de ADN bicatenario circular largo de 5,25 pares de kilobase. El genoma de SV40 consta de dos regiones reguladoras, la región activadora/de origen y la región de poliadenilación. La región activadora/origen tiene un largo de 500 pares de bases y comprende dos activadores dirigidos de manera opuesta, el activador temprano y tardío (SVEP y SVLP, respectivamente), el origen de la repllcaclón y la señal de empaquetamiento. La región de poliadenilación tiene un largo de 100 pares de bases y contiene las señales de poliadenilación de los transcritos tanto temprano como tardío. El SVEP conduce la expresión del transcrito primario temprano que es sometido a corte y empalme por factores de corte y empalme codificados por el huésped en 2 ARNm diferentes que codifican antígenos de tumores (T) pequeños y grandes.

El antígeno T grande es la proteína asociada a replicasa requerida para replicación de ADN y para activación del SVLP. Aunque la función precisa del antígeno T pequeño en replicación de virus ha permanecido no clara, se requiere antígeno T pequeño para la transformación de varios tipos de células de mamífero, junto con antígeno T grande. Los efectos primarios de antígeno T pequeño tienen lugar por su Interacción con proteína serina-treonina fosfatasa 2A. El dominio de unión de fosfatasa 2A de antígeno T pequeño está localizado en el extremo carboxi- terminal único del antígeno T pequeño.

Está bien documentado en la técnica anterior que se requieren tanto antígeno T grande como antígeno T pequeño para replicación eficaz de poliomavirus (Fahrbach K. M. et al., Vlrology 370 (2): 255 - 263, 2.008).

SVLP conduce la expresión del último transcrito primario que se corta y empalma por factores de corte y empalme codificados por el huésped... [Seguir leyendo]

Método para la producción de partículas de vector poliomavírico recombinante que no codifiquen un antígeno T pequeño poliomavírico funcional, que comprende las etapas de:

a. Proporcionar una estirpe celular permisiva para poliomavirus natural, comprendiendo dicha estirpe celular un gen codificador de un antígeno T grande poliomavírico funcional integrado de manera estable en el genoma de la célula, en el que la estirpe celular no comprende un gen codificador de un antígeno T pequeño poliomavírico funcional,

b. Introducir en dicha estirpe celular un ADN de poliomavirus que no codifique un antígeno T pequeño poliomavírico funcional y que tampoco codifique un antígeno T grande funcional,

c. Cultivar dichas células en un medio de crecimiento en condiciones en las que la estirpe celular produzca el antígeno T grande en trans y que permita la formación de partículas de vector poliomavírico recombinante y

d. Recoger las partículas de vector poliomavírico recombinante del cultivo celular.

Composición que comprende más de un millón de partículas de vector poliomavírico recombinante que no codifican un antígeno T pequeño poliomavírico funcional y que tampoco codifican un antígeno T grande, siendo dichas partículas de poliomavirus incapaces de replicación en células que sean permisivas para el poliomavirus natural, caracterizada por que la composición no contiene una sola partícula de poliomavirus que sea capaz de replicación en células que sean permisivas para el poliomavirus natural en el que dichas células no expresan un antígeno T grande poliomavírico funcional.

Composición según la reivindicación 2, en la que el poliomavirus es un poliomavirus de primate.

Composición según la reivindicación 3, en la que el poliomavirus es un poliomavirus de simio.

Composición según la reivindicación 4, en la que el poliomavirus se selecciona del grupo que consiste en SV40, SV12, poliomavirus linfotrópico, poliomavirus de mono verde africano y poliomavirus de chimpancé.

Composición según la reivindicación 5, en la que el poliomavirus es SV40.

Estirpe celular permisiva para un poliomavirus, que comprende partículas de vector poliomavírico recombinante que no comprenden un gen codificador de un antígeno T pequeño poliomavírico funcional y tampoco comprenden un gen codificador de un antígeno T grande funcional, comprendiendo dicha estirpe celular un gen integrado de manera estable en el genoma de la célula que codifica un antígeno T grande poliomavírico funcional y no comprendiendo un gen codificador de un antígeno T pequeño poliomavírico funcional.

Composición según las reivindicaciones 2 a 6, para uso como un medicamento.