Moléculas de ácido nucleico de Nicotiana y usos de las mismas.

Un cultivo de tejidos de células de tabaco regenerables, teniendo dichas células de tabaco una mutación en un gen de nicotina desmetilasa endógeno que tiene la secuencia definida en SEQ INO:

4, en donde la mutación es seleccionada del grupo consistente de una mutación puntual, una eliminación, una inserción, una duplicación y una inversión, en donde dicho cultivo de tejidos regenera plantas de tabaco capaces de expresar todas las características fisiologías y morfológicas de una planta de tabaco que tiene dicha mutación, y en donde dichas plantas de tabaco regeneradas exhiben expresión del gen o del producto genético mutados de nicotina desmetilasa con respecto a una planta de control no mutada, o la nicotina desmetilasa codificada por el gen mutado exhibe actividad enzimática reducida con respecto a una nicotina desmetilasa no mutada.

Moléculas de ácido nucleico de Nicotiana y usos de las mismas

La presente invención se relaciona con un cultivo de tejidos de células de tabaco regenerables que tienen una mutación en un gen de nicotina desmetilasa endógeno, en donde dicha planta de tabaco regenerada exhibe expresión reducida del gen de nicotina desmetilasa mutado o producto genético, o la nicotina desmetilasa codificada por el gen mutado exhibe actividad enzimática reducida, como se define en las reivindicaciones. Adicionalmente, la presente invención es pertinente a un método para reducir la expresión o actividad enzimática de una nicotina desmetilasa en una planta de tabaco, y a un método para producir un producto de tabaco, como se define en las reivindicaciones.

Antecedentes

Durante la maduración o curado del tabaco la expresión de diversos genes es alterada. Tales genes pueden afectar las rutas metabólicas involucradas en la formación de numerosos metabolitos secundarios incluyendo terpenoides, polifenoles y alcaloides que afectan las características de calidad del producto final. Por ejemplo, la bioconversión de la nicotina para formar nornicotina durante la senescencia de la planta y en el postcultivo o fase de curado de las hojas se presentan muchas especies de Nicotiana. La nicotina es la fuente predominante de nornicotina. El alcaloide nornicotina, es un sustrato para la nitrosación mediada por microbios para formar la nitrosamina específica del tabaco (TSNA) N'-nitrosonornicotina (NNN) durante el curado de la hoja y subsecuentemente durante el almacenamiento y procesamiento de la hoja.

Los genes expresados durante la maduración o curado del tabaco pueden ser expresados constitutivamente, inducidos por etileno o por genes relacionados con la senescencia, por ejemplo, genes que codifican un citocromo p45. Los citocromos p45, por ejemplo, catalizan las reacciones enzimáticas para un rango diverso de sustratos químicamente disímiles que incluyen el metabolismo oxidativo, peroxidativo y reductor de sustratos endógenos y xenobióticos. En las plantas, los p45 participan en las rutas bioquímicas que incluyen la síntesis de productos vegetales tales como fenilpropanoides, alcaloides, terpenoides, lípidos, glicósidos cianogénicos, y glucosinolatos estudiados (Chappell, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46:521-547, 1995). Los citocromos p45, también conocidos como proteínas p45 hemotiolato, usualmente actúan como oxidasas terminales en cadenas de transferencia de electrones de componentes múltiples, denominadas sistemas de monooxigenasa que contienen p45. Reacciones específicas catalizadas por estos sistemas de enzimas incluyen desmetilación, hidroxilación, epoxidación, N-oxidación, sulfooxidación, y N-, S- y O- desalquilaciones, desulfonación, desaminación y reducción de grupos azo, nitro y N-óxido.

El papel diverso de las enzimas p45 de las plantas de Nicotiana ha estado implicado en la ejecución de una variedad de metabolitos vegetales tales como fenilpropanoides, alcaloides, terpenoides, lípidos, glicósidos cianogénicos, glucosinolatos, y una hueste de otras entidades químicas. Algunas enzimas p45 pueden impactar la composición de los metabolitos vegetales. Por ejemplo, se ha deseado durante mucho tiempo mejorar el sabor y aroma de ciertas plantas alterando un perfil de la planta de ácidos grasos seleccionados a través de cruzamientos; sin embargo, se sabe muy poco acerca de los mecanismos involucrados en el control de los niveles de esos constituyentes de las hojas. La subregulación o sobrerregulación de las enzimas p45 asociadas con la modificación de ácidos grasos puede facilitar la acumulación de ácidos grasos deseados que proveen cualidades fenotípicas de las hojas más preferidas.

La función de las enzimas p45 y sus papeles crecientes en los constituyentes vegetales están siendo aún descubiertos. Por ejemplo, se encontró que una clase especial de enzimas p45 catalizan la ruptura de ácidos grasos en aldehidos volátiles C6 y C9 y p-alcoholes que contribuyen de manera principal al olor "verde fresco" de frutas y vegetales. El nivel de otros p45 objetivo novedosos puede ser alterado para potenciar las cualidades de los constituyentes de las hojas modificando la composición en lípidos y en metabolitos de ruptura relacionados en las hojas de Nicotiana. Varios de estos constituyentes en la hoja son afectados por la senescencia que estimula la maduración de propiedades de calidad de las hojas. Todavía otros reportes han mostrado que las enzimas p45 juegan un papel funcional en la alteración de los ácidos grasos que están involucrados en las interacciones planta- patógeno y resistencia a enfermedades.

La gran multiplicidad de las formas de la enzima p45, sus estructuras y funcionamiento diferentes han hecho que su investigación acerca de las enzimas p45 de la Nicotiana sea muy difícil antes de la presente invención. Además, la clonación de las enzimas p45 ha sido obstaculizada al menos en parte porque estas proteínas localizadas en la membrana están presentes típicamente en baja abundancia y frecuentemente son inestables durante la purificación. Por lo tanto, existe una necesidad para identificar las enzimas p45 en plantas y las secuencias de ácidos nucleicos asociadas con estás enzimas p45. En particular, solo se han reportado unas pocas proteínas de citocromo p45 y Nicotiana. La divulgación descrita aquí abarca el descubrimiento de los citocromos 45 y fragmentos de citocromo p45 que corresponden a varios grupos de especies de P45 con base en su identidad de secuencia.

Además de las secuencias de p45, la presente divulgación abarca el descubrimiento de otras secuencias constitutivas e inducidas por etileno o senescencia que apuntan a la necesidad de regular las rutas metabólicas involucradas en la formación de metabolitos secundarios que afectan la calidad de un producto de tabaco. Estas secuencias también son útiles en el desarrollo de germoplasmas vegetales que tienen características deseables para utilización en programas de cruzamiento para desarrollar germoplasmas más deseables, y especialmente germoplasmas tipo no GMO (organismo genéticamente modificado).

Resumen de la invención

Los presentes inventores han identificado y caracterizado secuencias constitutivas, e inducidas por etileno y senescencia, incluyendo un clon genómico de la nicotina desmetilasa, del tabaco. También se describe aquí el uso de estas secuencias en métodos de cruzamiento y en métodos para crear una planta (por ejemplo una planta transgénica) que tiene características deseables, tales como niveles alterados de nornicotina o N'-nitrosonornicotina ("NNN") o ambos con respecto a una planta de control.

Una planta de tabaco puede ser identificada como una variante para la expresión del gen de nicotina desmetilasa, por ejemplo, a los niveles transcripcional, postranscripcional y de traducción o a nivel de la actividad enzímátíca) utilizando las secuencias descritas aquí y métodos estándar conocidos en el arte.

La planta de tabaco induce un gen endógeno de nicotina desmetilasa que tiene una mutación (por ejemplo, una eliminación, sustitución, mutación puntual, translocación, inversión, duplicación o una inserción). La planta de tabaco puede incluir un gen de nicotina desmetilasa que tiene una mutación nula, incluye un gen recombinante que silencia un gen de nicotina desmetilasa endógeno, o incluye una nicotina desmetilasa que tiene actividad enzimática reducida o alterada. El gen de nicotina desmetilasa de la planta de tabaco puede estar ausente. La plan de tabaco puede ser una planta transgénica.

La planta de tabaco incluye una molécula de ácido nucleico endógena seleccionada del grupo consistente de las secuencias de ácidos nucleicos mostradas en la Figura 1, Figuras 3 a 7 y Figuras 1-17, en donde el ácido nucleico incluye una mutación. Mutaciones de ejemplo incluyen eliminación, sustitución, mutación puntual, translocación, inversión, duplicación o una inserción.

La primera planta de tabaco del método antes descrito puede incluir una molécula de ácido nucleico endógena seleccionada del grupo consistente de las secuencias de ácidos nucleicos mostradas en la Figura 1, Figuras 3 a 7 y Figura 1-17 en donde el ácido nucleico incluye una mutación nula. La plata de tabaco puede incluir un gen recombinante que silencia la expresión de la molécula de ácido nucleico endógena una molécula de ácido nucleico endógena seleccionada del grupo consistente de las secuencias de ácidos nucleicos mostradas en la Figura 1, Figuras 3 a 7, y Figuras 1-17.

La planta de tabaco incluye, si se desea, una molécula de ácido nucleico endógena seleccionada del grupo consistente de las secuencias de ácidos nucleicos mostradas en... [Seguir leyendo]

1. Un cultivo de tejidos de células de tabaco regenerables, teniendo dichas células de tabaco una mutación en un gen de nicotina desmetilasa endógeno que tiene la secuencia definida en SEQ INO: 4, en donde la mutación es seleccionada del grupo consistente de una mutación puntual, una eliminación, una inserción, una duplicación y una inversión, en donde dicho cultivo de tejidos regenera plantas de tabaco capaces de expresar todas las características fisiologías y morfológicas de una planta de tabaco que tiene dicha mutación, y en donde dichas plantas de tabaco regeneradas exhiben expresión del gen o del producto genético mutados de nicotina desmetilasa con respecto a una planta de control no mutada, o la nicotina desmetilasa codificada por el gen mutado exhibe actividad enzimática reducida con respecto a una nicotina desmetilasa no mutada.

2. El cultivo de tejidos de células de tabaco regenerables de la reivindicación 1, en donde las células regenerables son embriones, células meristemáticas, semillas, polen, hojas, raíz, puntas de raíz, o flores o son protoplastos o callus derivados de los mismos.

3. Un método para producir un producto de tabaco que comprende:

(a) proveer tabaco curado a partir de una planta de tabaco que tiene una mutación en un gen de nicotina desmetilasa endógeno que tiene la secuencia fijada en SEQ ID NO: 4, en donde la mutación es seleccionada del grupo consistente de una mutación puntual, una eliminación, una inserción, una duplicación y una inversión, y en donde dicha planta de tabaco exhibe expresión reducida del gen o del producto genético de nicotina desmetilasa mutado con respecto a una planta de control no mutada, o la nicotina desmetilasa codificada por el gen mutado exhibe actividad enzimática reducida con respecto a una nicotina desmetilasa no mutada; y

(b) preparar un producto de tabaco utilizando dicho tabaco curado; particularmente en donde dicho producto de tabaco es una hoja o tallo curados, un rapé húmedo o seco, un tabaco para mascar, un producto de cigarrillo, un producto de cigarro, un cigarrillo, un tabaco para pipa o bidis.

4. Un método para reducir la expresión o actividad enzimática de una nicotina desmetilasa en una planta de tabaco con respecto a una planta de control, comprendiendo dicho método:

(a) expresar un transgen que codifica un ácido nucleico antisentido que exhibe expresión de un ácido nucleico endógeno seleccionado del grupo consistente de las secuencias de ácidos nucleicos SEQ ID NOS: 4 o 7 en dicha planta, en donde la planta de control carece de transgen; o

(b) expresar un transgen que cosuprime un ácido nucleico endógeno seleccionado del grupo consistente de SEQ ID NOS: 4 y 7 en dicha planta, en donde la planta de control carece del transgen; o

(c) expresar un producto de gen negativo dominante en dicha planta que inhibe la expresión de un ácido nucleico endógeno seleccionado del grupo consistente de las secuencias de ácidos nucleicos de SEQ ID NOS: 4 o 7, en donde dicha expresión reducida ocurre a nivel transcripcional, a nivel de traducción, o a nivel postraducción, en donde la planta de control carece del producto de gen negativo dominante.

5. El cultivo de tejidos, o método de la reivindicación 1, 2 o 3, en donde dicha mutación es una mutación puntual.

6. El cultivo de tejidos, o un método de la reivindicación 1, 2 o 3, en donde dicha mutación es una eliminación.

7. El cultivo de tejido, o método de la reivindicación 1, 2 o 3, en donde dicho tabaco es Nicotiana tabacum, Nicotiana sylvestñs, Nicotiana tomentosiformis o Nicotiana glauca.

8. El cultivo de tejidos, o método de la reivindicación 1, 2, 3 o 4, en donde la expresión del gen de nicotina desmetilasa endógeno mutante que tiene la secuencia fijada en SEQ ID NO: 4 es reducida en al menos 3% en la planta de tabaco mutante con relación al nivel de expresión en la planta de control no mutante.

9. El cultivo de tejidos, o método de la reivindicación 1, 2, 3 o 4, en donde la actividad enzimática de la nicotina desmetilasa mutante codificada por el gen de nicotina desmetilasa endógeno que tiene la secuencia fijada en SEQ ID NO: 4 es disminuido en al menos 1% en la planta de tabaco mutante con respecto a la nicotina desmetilasa no mutada.