Métodos y kits para análisis de metilación en trastornos proliferativos celulares colorrectales.

Un método para la detección de carcinoma colorrectal en un sujeto,

que comprende determinar el nivel de expresión de RASSF2 en una muestra biológica seleccionada del grupo que consiste en plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, y células sanguíneas, aislada de dicho sujeto, en donde dicho nivel de expresión se determina por medio de la detección de la presencia o ausencia de metilación de CpG dentro de dicho gen, en donde la presencia de metilación indica la presencia de carcinoma colorrectal.

Métodos y kits para análisis de metilación en trastornos proliferativos celulares colorrectales Campo de la invención

La presente invención se refiere a secuencias de ADN genómico que muestran patrones de expresión alterados en estados de enfermedad con respecto a la normalidad. Las realizaciones concretas proporcionan métodos y kits útiles para detectar trastornos proliferativos de las células. Los métodos para la detección y el diagnóstico de los trastornos proliferativos de las células proporcionados en la presente Invención, se utilizan para el diagnóstico del cáncer colorrectal.

Lista de secuencias

Se incluye con esta solicitud una lista de secuencias en formato papel y que comprende los SEQ ID NO: 7, 12-14, 27, 28, 37 a 42, 55, 56, 65-7, 83-85 y 17-116 y se Incorpora como referencia en su totalidad a la presente memoria.

Antecedentes

Incidencia y diagnóstico del cáncer.

El cáncer es la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos. Las tasas de mortalidad podrían mejorar significativamente si se pudieran mejorar los métodos de escrutinio actuales en términos de la conformidad del paciente, la sensibilidad y la facilidad de escrutinio. Los métodos recomendados actuales para el diagnóstico del cáncer son a menudo costosos y no son adecuados para su aplicación como pruebas de escrutinio para la población general.

En los Estados Unidos, la Incidencia anual de cáncer colorrectal es de aproximadamente 15., con 56.6 Individuos que mueren por cáncer colorrectal cada año. El riesgo de cáncer colorrectal a lo largo de la vida en la población general es de aproximadamente 5 a 6 por ciento. A pesar de los intensos esfuerzos en los últimos años en el escrutinio y la detección temprana del cáncer de colon, hasta hoy la mayor parte de los casos se diagnostican en fase avanzada con metástasis regional o distante. Si bien las opciones terapéuticas incluyen cirugía y quimioterapia coadyuvante o paliativa, la mayor parte de los pacientes mueren por el progreso de su cáncer en unos pocos meses. La identificación de los cambios moleculares que subyacen al desarrollo del cáncer de colon puede ayudar a desarrollar nuevas opciones de verificación, escrutinio, diagnóstico y terapia que podrían mejorar la mala prognosis general para estos pacientes.

Las pautas actuales para el escrutinio colorrectal de acuerdo con la American Cáncer Society utilizan una de cinco diferentes opciones para el escrutinio en individuos de riesgo medio de 5 años de edad o más mayores. Estas opciones incluyen 1) prueba de sangre oculta en heces (FOBT) anualmente, 2) sigmoidoscopía flexible cada cinco años, 3) FPBT anual más sigmoidoscopía flexible cada cinco años, 4) enema de bario de doble contraste (DCBE) cada cinco años o 5) colonoscopia cada diez años. Incluso aunque estos procedimientos de prueba son bien aceptados por la comunidad médica, la implementación de un escrutinio generalizado para el cáncer colorrectal no se ha logrado. La conformidad por parte del paciente es un factor principal para el uso limitado debido a la incomodidad o inconveniencia asociadas con los procedimientos. La prueba FOBT, aunque no es un procedimiento invasivo, requiere restricciones en la dieta y otras 3-5 días antes de la prueba. Los niveles de sensibilidad para este ensayo también son muy bajos para el adenocarcinoma colorrectal con una amplia variabilidad que depende de la prueba. Las medidas de sensibilidad para la detección de adenomas son incluso menores puesto que la mayoría de los adenoma no sangran. Por el contrario, la sensibilidad para los procedimientos más invasivos tales como la sigmoidoscopía y la colonoscopia es bastante elevada debido a la visualización directa del lúmen del colon. Pruebas no aleatorizadas han evaluado la eficacia de estas técnica, no obstante, utilizando datos de estudios de casos y controles y datos del National Polyp Study (U.S.) se ha demostrado que la eliminación de pólipos adenomatosos da como resultado una reducción de 76-9% en la incidencia de CRC. La sigmoidoscopía tiene la limitación de visualizar solamente el lado izquierdo del colon dejando las lesiones del colon derecho sin detectar. Ambos procedimientos de exploración son costosos, requieren una preparación catártica y tiene un mayor riesgo de morbididad y mortalidad. Claramente se necesitan pruebas mejoradas con una mayor sensibilidad, especificidad, facilidad de uso y disminución de los costes antes de que el escrutinio amplio general del cáncer colorrectal se convierta en una rutina.

La detección precoz del cáncer colorrectal se basa generalmente en la prueba de sangre oculta en las heces (FOBT) realizada anualmente en individuos asintomáticos. Las recomendaciones actuales adaptadas por varias organizaciones para el cuidado de la salud, incluyendo la American Cáncer Society, reclaman pruebas de sangre oculta en las heces a principios de la edad de 5, repetidas anualmente hasta que el paciente ya no se pueda beneficiar del escrutinio. Una FOBT positiva conduce a un examen colonoscópico del intestino; un procedimiento costoso e invasivo, con una tasa de complicaciones graves de uno por cada 5. exámenes. Solamente 12% de los pacientes con deposiciones positivas para sangre son diagnosticados de cáncer o de pólipos grandes en el momento de la colonoscopia. Numerosos estudios muestran que el escrutinio FOBT no mejora la mortalidad

relacionada con el cáncer o la supervivencia general. La conformidad con la prueba de sangre oculta ha sido escasa; menos de 2 por ciento de la población se ofrece o completa una FOBT recomendada. SI la FOBT se realiza apropiadamente, el paciente recoge una muestra fecal de tres movimientos consecutivos del Intestino. Las muestras se obtienen mientras el paciente se adhiere a unas pautas dietéticas y evita medicaciones que se sabe que inducen sangrado gastrointestinal oculto. En realidad, los médicos frecuentemente no logran instruir adecuadamente a los pacientes, los pacientes frecuentemente no siguen las directrices del protocolo, y algunos pacientes encuentran la tarea de recoger las muestras fecales difícil o desagradable, por consiguiente la conformidad con la prueba de sangre oculta anual es escasa. Si la sensibilidad y la especificidad de la prueba se pudieran mejorar por encima de las de los métodos actuales, la frecuencia de la prueba se podría reducir, la recogida de muestras consecutivas se podría eliminar, las modificaciones de la dieta y el programa de medicación se podrían eliminar, y la conformidad del paciente aumentaría. Para complicar el problema de la conformidad, la sensibilidad y la especificidad de la FOBT para detectar el cáncer de colon son escasas. La escasa especificidad de la prueba conduce a una colonoscopia innecesaria, añadiendo un coste considerable al escrutinio del cáncer de colon.

Se ha calculado que la especificidad de la FOBT es a lo sumo de 96%, con una sensibilidad de 43% (adenomas) y de 5% (carcinoma colorrectal). La sensibilidad se puede mejorar utilizando un inmunoanálisis FOBT tal como el producido bajo el nombre de fábrica 'InSure', con una sensibilidad mejorada de 77% (adenomas) y 88,9% (carcinoma colorrectal).

Marcadores de enfermedades moleculares. Los marcadores de enfermedades moleculares ofrecen varias ventajas sobre otros tipos de marcadores, siendo una ventaja que incluso las muestras de tamaños muy pequeños y/o las muestras cuya arquitectura de tejidos no se ha mantenido pueden ser analizadas bastante eficazmente. En la última década se ha demostrado que numerosos genes son expresados diferencialmente entre la normalidad y los carcinomas de colon. Sin embargo, no se ha demostrado que ningún marcador solo o combinado, sea suficiente para el diagnóstico de los carcinomas de colon. Se ha demostrado recientemente que los enfoques multi- dimensionales basados en ARNm son capaces de proporcionar mejores medios para distinguir entre diferentes tipos de tumores y lesiones benignas y malignas. Sin embargo, su aplicación como herramienta de diagnóstico rutinaria en el entorno clínico se ve obstaculizada por la extrema inestabilidad del ARNm, los cambios de expresión que se producen rápidamente después de ciertos desencadenantes (p. ej., la recogida de muestras), y, lo más importante, la gran cantidad de ARNm necesario para el análisis (Lipshutz, R. J. et al., Nature Genetics 21:2-24, 1999; Bowtell, D. D. L. Nature genetics suppl. 21:25-32, 1999), que a menudo no se puede obtener de una biopsia rutinaria.

Se ha sugerido el uso de marcadores biológicos para mejorar adicionalmente la sensibilidad y la especificidad de la FOBT, los ejemplos de tales pruebas incluyen el ensayo de análisis de las deposiciones PreGen-Plus asequible de EXACT Sciences que tiene una sensibilidad de 2% (adenoma) y 52% (carcinoma... [Seguir leyendo]

1. Un método para la detección de carcinoma colorrectal en un sujeto, que comprende determinar el nivel de expresión de RASSF2 en una muestra biológica seleccionada del grupo que consiste en plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, y células sanguíneas, aislada de dicho sujeto, en donde dicho nivel de expresión se determina por medio de la detección de la presencia o ausencia de metilación de CpG dentro de dicho gen, en donde la presencia de metilación indica la presencia de carcinoma colorrectal.

2. El método para la detección de carcinoma colorrectal en un sujeto de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la determinación del nivel de expresión del gen de Septina 9, en donde dicho nivel de expresión se determina por medio de la detección de la presencia o ausencia de metilación de CpG dentro de dicho gen, en donde la presencia de metilación indica la presencia de carcinoma colorrectal.

3. Un método para la detección de carcinoma colorrectal en un sujeto, de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende poner en contacto el ADN genómico aislado de una muestra biológica seleccionada del grupo que consiste en plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, y células sanguíneas, obtenida de dicho sujeto con al menos un reactivo, o serie de reactivos que distinguen entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos una región diana del ADN genómico, en donde la al menos una región diana es una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 7, en donde dichos nucleótidos contiguos comprenden al menos una secuencia de dinucleótidos CpG, y por medio del cual se proporciona la detección del carcinoma colorrectal, al menos en parte.

4. Un método para la detección de carcinoma colorrectal en un sujeto, que comprende poner en contacto el ADN genómico aislado de una muestra biológica obtenida de dicho sujeto con al menos un reactivo, o serie de reactivos que distinguen entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos dos regiones diana del ADN genómico, en donde una primera región diana es una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos de al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 14, respectivamente, y en donde una segunda región diana es una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 7, respectivamente, en donde dichos nucleótidos contiguos comprenden al menos una secuencia de dinucleótidos CpG, y por medio del cual se proporciona la detección del carcinoma colorrectal, al menos en parte.

5. Un método para la detección de carcinoma colorrectal, de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

a) extraer o aislar de otra forma ADN genómico a partir de una muestra biológica seleccionada del grupo que consiste en plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, y células sanguíneas, obtenida de un sujeto;

b) tratar el ADN genómico de a), o un fragmento del mismo, con uno o más reactivos, preferiblemente un reactivo seleccionado del grupo que comprende bisulfito, sulfito de hidrógeno, disulfito, y combinaciones de los mismos, para convertir las bases de citosina que están sin metilar en su posición 5' en uracilo o en otra base que sea detectablemente distinta de la citosina en términos de propiedades de hibridación;

c) poner en contacto el ADN genómico tratado, o el fragmento tratado del mismo, con una enzima de amplificación y al menos un cebador que comprende, una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos que es complementaria a, o híbrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 27, 28, 55, 56, y complementos de las mismas, en donde el ADN genómico tratado o el fragmento del mismo es amplificado para producir al menos un producto amplificado, o no es amplificado; y

d) determinar, basándose en la presencia o ausencia de, o en una propiedad de dicho producto amplificado, el estado o el nivel de metilación de al menos un dinucleótido CpG del SEC ID NO: 7, o un promedio, o un valor que refleja un estado o nivel de metilación promedio de una pluralidad de dinucleótidos CpG del SEC ID NO: 7, por medio del cual se proporciona la detección del carcinoma colorrectal, al menos en parte.

6. El método de la reivindicación 5, en donde poner en contacto o amplificar en c) comprende el uso de al menos un método seleccionado del grupo que comprende: el uso de una ADN polimerasa resistente al calor como enzima de amplificación; el uso de una polimerasa que carece de actividad exonucleasa 5'-3'; el uso de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR); la generación de una molécula de ácido nucleico amplificado que lleva un marcador detectable.

7. El método de la reivindicación 5, que comprende adicionalmente en la etapa d) el uso de al menos una molécula de ácido nucleico o una molécula de ácido peptidonucleico que comprende en cada caso una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o híbrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 27, 28, 55, 56, y complementos de los mismos, en donde dicha molécula de ácido nucleico o molécula de ácido peptidonucleico suprime la amplificación del ácido nucleico al que se híbrida, o en donde la determinación en d) comprende la hibridación de al menos una molécula de ácido nucleico o un molécula de ácido peptidonucleico en cada caso que comprende una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o híbrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 27, 28, 55, 56, y complementos de los mismos.

8. Un método para la detección de carcinoma colorrectal, de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende

a) extraer o aislar de otra forma ADN genómico a partir de una muestra biológica seleccionada del grupo que consiste en plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, y células sanguíneas, obtenida de un sujeto;

b) digerir el ADN genómico de a), o un fragmento del mismo, con una o más enzimas de restricción sensibles a la metilación; poner en contacto el producto digerido con la enzima de restricción de ADN de b), con una enzima de amplificación y al menos dos cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia que comprende al menos un dinucleótido CpG del SEC ID NO: 7;

c) determinar, basándose en la presencia o ausencia de un producto amplificado, en donde la presencia o ausencia de un producto amplificado se determina preferiblemente por medio de la hibridación con al menos un ácido nucleico o un ácido peptidonucleico que es idéntico, complementario, o híbrida en condiciones restrictivas o muy restrictivas con un segmento de al menos 16 bases de longitud del SEQ ID NO: 7, el estado o el nivel de metilación de al menos un dinucleótido CpG del SEC ID NO: 7, por medio del cual se proporciona la detección del carcinoma colorrectal, al menos en parte.

9. El uso de un ácido nucleico tratado derivado del SEQ ID NO: 7, en donde el tratamiento es adecuado para convertir al menos una base de citosina no metilada de la secuencia de ADN genómico en uracilo u otra base que es detectablemente distinta de la citosina en términos de hibridación, o el uso de un ácido nucleico, que comprende al menos 16 nucleótidos contiguos, preferiblemente al menos 5 nucleótidos contiguos, de una secuencia de ADN genómico tratada seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 27, 28, 55, 56, y secuencias complementarias a estas, en donde dicho ácido nucleico comprende al menos una base que ha sido convertida de una base de citosina no metilada de la secuencia de ADN genómico en uracilo u otra base que sea detectablemente distinta de la citosina en términos de hibridación, en donde dicho ácido nucleico comprende al menos una secuencia de dinucleótido CpG, TpG o CpA, o el uso de un ácido nucleico, que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 27, 28, 55, 56, y las secuencias complementarias a estas, en un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

1. Un kit adecuado para realizar el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, que comprende (a) un reactivo de bisulfito; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo de bisulfito y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos que contiene dos oligonucleótidos cuyas secuencias en cada caso son idénticas, son complementarias, o hibridan en condiciones restrictivas o altamente restrictivas con un segmento de 9 o más preferiblemente 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada entre los SEQ ID NO: 27, 28, 55, y 56, en donde dicho kit comprende adicionalmente al menos un conjunto de oligonucleótidos que contiene dos oligonucleótidos cuyas secuencias en cada caso son idénticas, son complementarias, o hibridan en condiciones restrictivas o altamente restrictivas con un segmento de 9 o más preferiblemente 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada entre los SEQ ID NO: 37 a SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 65 a SEQ ID NO: 7, o un kit adecuado para llevar a cabo el método de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende (a) un reactivo de una enzima de restricción sensible a la metilación; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos o uno o una pluralidad de ácidos nucleicos o ácidos peptidonucleicos que son idénticos, son complementarias, o hibridan en condiciones restrictivas o altamente restrictivas con un segmento de al menos 9 bases de longitud de una secuencia seleccionada del SEC ID NO: 7; y opcionalmente (d) instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit, en donde dicho kit comprende adicionalmente (e) al menos un conjunto de oligonucleótidos o uno o una pluralidad de ácidos nucleicos o ácidos peptidonucleicos que son idénticos, son complementarios, o hibridan en condiciones restrictivas o altamente restrictivas con un segmento de al menos 9 bases de longitud de una secuencia seleccionada entre el SEQ ID NO: 12 al SEQ ID NO: 14.

11. El uso de un kit de acuerdo con la reivindicación 1 en el diagnóstico del cáncer colorrectal.