Procedimiento y disposición de electrodos para tratar células adherentes.

Disposición de electrodos (10, 17, 20), especialmente para solicitar células adherentes con al menos un campoeléctrico,

que comprende al menos dos electrodos (12, 18, 21) que presentan cada uno de ellos al menos unasuperficie (16, 32) que está dispuesta enfrente de la superficie correspondiente (16, 32) del respectivo otro electrodo(12, 18, 21), estando dispuesto al menos parcialmente un material eléctricamente aislante (11, 19, 26) entre lassuperficies (16, 32) de los electrodos (12, 18, 21), caracterizada por que las superficies (16, 32) estáncompletamente separadas una de otra por el material aislante (11, 19, 26).

Procedimiento y disposición de electrodos para tratar células adherentes.

La invención concierne a una disposición de electrodos, especialmente para solicitar células adherentes con al menos un campo eléctrico, que comprende al menos dos electrodos que presentan cada uno de ellos al menos una superficie que está dispuesta enfrente de la superficie correspondiente del respectivo otro electrodo, estando dispuesto al menos parcialmente entre la superficie de los electrodos un material eléctricamente aislante. La invención concierne también a un procedimiento para solicitar células adherentes con al menos un campo eléctrico, en el que se genera el campo eléctrico por la aplicación de una tensión a al menos dos electrodos.

La solicitación de células vivas con un campo eléctrico o un impulso de tensión, la llamada electroporación o electrotransfección, se emplea desde hace años en células en los más diferentes estados. Estas células se presentan como células individuales en suspensión en una solución tampón, en el estado adherente en un recipiente de cultivo, casi siempre en el fondo de un receptáculo de material sintético y en vivo, en donde las células están incrustadas, generalmente en un estructura tisular, dentro de una matriz extracelular. En principio, en la electroporación se introducen en las células las moléculas extrañas de una solución tampón adaptada a las células o un medio de cultivo celular mediante un flujo de corriente de corta duración, haciéndose la membrana celular permeable para las moléculas extrañas por el efecto de los impulsos de tensión eléctrica o del campo eléctrico y el flujo de corriente así producido. La suspensión celular se encuentra aquí frecuentemente en una llamada cubeta, es decir, un pequeño recipiente abierto cuyo espacio para las muestras presenta en las paredes laterales dos electros paralelos opuestos que sirven para aplicar la tensión eléctrica. A través de los “poros” de la membrana celular producidos en breve tiempo llegan primero las moléculas biológicamente activas al citoplasma, en el que pueden ejercer eventualmente ya su función a examinar, y a continuación, en determinadas condiciones, alcanzan también el núcleo de las células. Mediante la aplicación de corta duración de un fuerte campo eléctrico, es decir, un corto impulso de tensión con alta densidad de corriente, se pueden fusionar también células, derivados celulares, partículas subcelulares y/o vesículas. En esta llamada electrofusión se ponen las células en estrecho contacto con la membrana, por ejemplo primeramente por medio de un campo eléctrico alterno no homogéneo. Gracias a la aplicación subsiguiente de un impulso de campo eléctrico se produce entonces la interacción de partes de la membrana que conduce finalmente a la fusión. Para la electrofusión se pueden emplear aquí dispositivos y aparatos comparables, como para la electroporación. Además, las células vivas pueden ser estimuladas también por campos eléctricos de una manera que varía sus propiedades.

Se conoce por el documento WO 2005/056788 A1, por ejemplo, un procedimiento de electroporación en el que crecen células sobre una membrana microporosa que se encuentra entre dos superficies de electrodo paralelamente dispuestas.

El documento US-A-5 134 070 describe aplicaciones y dispositivos de electroporación de células que crecen sobre una superficie eléctricamente conductora que sirve de electrodo. El recipiente de cultivo se cubre desde arriba con un contraelectrodo de forma de placa, formándose una rendija a través de la cual son posibles descargas eléctricas.

Se conoce también por el documento WO 2008/104086 A1 un dispositivo en el que las células crecen sobre superficies de electrodo coplanarias. El contacto eléctrico entre los electrodos se establece a través del medio de cultivo celular dispuesto sobre las células, estando las dos zonas de electrodo separadas por una barrera aislanteque, no obstante, admite un puente de electrolito entre los electrodos. Éstos pueden consistir, por ejemplo, en óxido de indio-estaño que hace posible, como semiconductor transparente, un análisis microscópico de las células.

Se conoce por el documento WO 2009/131972 A1 un dispositivo de electroporación de células que crecen de manera adherente sobre una placa redonda de forma de disco. El dispositivo presenta dos electrodos dispuestos paralelos uno a otro, encontrándose un electrodo sobre la superficie cóncava de un cilindro exterior y encontrándose el otro electrodo sobre la superficie convexa de un cilindro interior.

Se conoce también por el documento US 2009/0305380 A1 un dispositivo de electroporación de células que están inmovilizadas sobre una superficie fija. El campo eléctrico con el que se solicitan las células es generado por una disposición de pares de electrodos que, dispuestos muy juntos uno a otro, se encuentran sobre una superficie dispuesta por encima de la superficie fija. Los electrodos están formados por trazas eléctricas que están aplicadas como un chapado sobre la superficie. Los dos electrodos de un par de electrodos están dispuestos aquí tan juntos uno a otro que no puede encontrarse más de una células dentro de la distancia mas pequeña entre los dos electrodos.

El documento US-A-6 352 853 describe disposiciones de electrodos de forma de peine para la electrotransfección de células que se disponen en forma de una matriz que comprende un gran número de pares de electrodos. Cada par de electrodos individual, que está formado por dos electrodos yuxtapuestos de disposiciones de electrodos contiguas, penetra entonces en una cavidad de una placa multipocillo. Los dos electrodos de un par de electrodos se separan parcialmente uno de otro por medio de un distanciador de material no conductor.

La firma BTX comercializa con el PetriPulser® una disposición de placas de electrodo planoparalelas de polaridades alternas que pueden aplicarse perpendicularmente sobre células que crecen de forma adherente en un recipiente de cultivo. Los electrodos se sumergen aquí en el sobrante del cultivo, llenándose con el medio de cultivo los espacios intermedios entre las distintas placas de electrodo. Un inconveniente esencial de esta disposición reside en que la mayor parte de la corriente escapa por el medio de cultivo exento de células que se encuentra sobre las células. Sin embargo, el campo es operativo solamente en el campo de borde del fondo del recipiente, en donde se encuentra las células, de modo que se tienen que aportar corrientes innecesariamente altas. Asimismo, se tiene que partir de una alta mortalidad de las células debido a variaciones del valor del pH y a la alta corriente. Además, se tiene que diseñar muy grande el suministro de tensión para impulsos de tensión de larga duración a fin de aportar estas grandes corrientes y, por tanto, estas grandes cantidades de carga y potencias. Por otro lado, se tiene que aplicar un volumen grande que sea adecuado para la electroporación y que contenga el sustrato a transfeccionar en concentración suficientemente alta, con lo que la cantidad de sustrato es correspondientemente también más alta.

La invención se basa en el problema de crear una disposición de electrodos y un procedimiento que hagan posible un tratamiento eficiente de células adherentes con un campo eléctrico sin que se necesiten densidades de corriente demasiado altas.

El problema se resuelve según la invención con la disposición de electrodos de la clase citada al principio en la que las superficies de los electrodos están completamente separadas una de otra por el material eléctricamente aislante. Gracias a esta solución según la invención se consigue que el campo eléctrico pueda concentrarse en la zona de las células a tratar, con lo que fluye a través de las células un impulso de tensión o la corriente producida por éste, sin que se descargue como no utilizada una parte principal de la misma en el electrolito dispuesto sobre las células. De este modo, por un lado, se puede dimensionar moderadamente el dispositivo de generación de impulsos y, por otro lado, se pueden evitar fuertes variaciones del valor del pH en el medio que se generarían en caso contrario a consecuencia de la electrolisis por efecto de grandes cantidades de cargas circulantes. Se garantiza también con el dispositivo según la invención que el tratamiento eléctrico distribuido espacialmente del modo más uniforme posible se efectúe a través de la superficie de cultivo y se minimicen zonas con células no tratadas. La proporción porcentual de células exitosamente tratadas (por ejemplo transfeccionadas) y la tasa de supervivencia, así como, en caso de que se emplee ADN o ARNm, el nivel de expresión por célula,... [Seguir leyendo]

1. Disposición de electrodos (10, 17, 20) , especialmente para solicitar células adherentes con al menos un campo eléctrico, que comprende al menos dos electrodos (12, 18, 21) que presentan cada uno de ellos al menos una superficie (16, 32) que está dispuesta enfrente de la superficie correspondiente (16, 32) del respectivo otro electrodo (12, 18, 21) , estando dispuesto al menos parcialmente un material eléctricamente aislante (11, 19, 26) entre las superficies (16, 32) de los electrodos (12, 18, 21) , caracterizada por que las superficies (16, 32) están completamente separadas una de otra por el material aislante (11, 19, 26) .

2. Disposición de electrodos según la reivindicación 1, caracterizada por que están previstos al menos tres, preferiblemente al menos 4 ó 5 y especialmente 6-12 electrodos (12, 18, 21) .

3. Disposición de electrodos según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada por que los electrodos (12, 18, 21) están configurados en forma de placas o de clavijas.

4. Disposición de electrodos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que las superficies (16, 32) son superficies laterales de placas de electrodo dispuestas en forma planoparalela.

5. Disposición de electrodos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que el espacio entre los electrodos (12, 18, 21) delimitado por las superficies (16, 32) de los electrodos (12, 18, 21) está completamente lleno del material aislante (11, 19, 26) .

6. Disposición de electrodos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que el material aislante (11, 19, 26) es un polímero termoplástico, preferiblemente policloruro de vinilo, poliestireno, polipropileno, polietileno y/o policarbonato.

7. Disposición de electrodos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada por que los electrodos (12, 18, 21) consisten en metal y/o en un material sintético eléctricamente conductor.

8. Disposición de electrodos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada por que la disposición de electrodos (10, 17, 20) presenta al menos un distanciador (27) en al menos un lado vuelto hacia las células.

9. Disposición de electrodos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada por que la disposición de electrodos (10, 17, 20) está prevista para insertarse en al menos un recipiente (14) al menos parcialmente lleno de líquido, preferiblemente un recipiente (14) a cuya superficie de fondo (15) se adhieren células vivas, y por que el material aislante (11, 19, 26) desaloja al menos una parte del líquido durante la inserción en el recipiente (14) .

10. Disposición de electrodos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada por que los electrodos (12, 18, 21) están dispuestos al menos parcialmente en el lado inferior (25) de un sujetador (22) .

11. Disposición de electrodos según la reivindicación 10, caracterizada por que el sujetador (22) está configurado de tal manera que puede insertarse en un recipiente de reacción o asentarse sobre éste, de modo que los electrodos (12, 18, 21) están en contacto con el recinto interior del recipiente de reacción.

12. Disposición de electrodos según la reivindicación 11, caracterizada por que el recipiente de reacción es parte de una placa multipocillo.

13. Uso de la disposición de electrodos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para solicitar células adherentes con al menos un campo eléctrico, especialmente para la electroporación de células adherentes, preferiblemente en forma de al menos un dispositivo de electrodos sumergibles.

14. Procedimiento para solicitar células adherentes con al menos un campo eléctrico, en el que se genera el campo eléctrico por la aplicación de una tensión a al menos dos electrodos (12, 18, 21) , caracterizado por que el campo eléctrico se concentra en el lado de los electrodos (12, 18, 21) vuelto hacia las células y/o se limita al espacio entre las células y el lado de los electrodos (12, 18, 21) vuelto hacia las células debido a que se coloca entre los electrodos (12, 18, 21) un material eléctricamente aislante (11, 19, 26) que separa completamente una de otra las superficies mutuamente opuestas (16, 32) de los electrodos (12, 18, 21) .

15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado por que se limita el campo eléctrico al espacio entre las células y un lado frontal descubierto de los electrodos (12, 18, 21) .

16. Procedimiento según la reivindicación 14 ó 15, caracterizado por que se introducen los electrodos (12, 18, 21) con un lado frontal descubierto en al menos un recipiente (14) a cuya superficie de fondo (15) se adhieren las células.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado por que se optimiza la acción del campo eléctrico sobre las células ajustando la distancia entre las células y los electrodos (12, 18, 21) .

Figura 1

Figura 2

Figura 4

Figura 5

Figura 6

Figura 7