Método de realización de un ensayo para neutralizar anticuerpos.

Un matodo para realizar un ensayo de neutralized& para el titulo de los anticuerpos en una muestra,

dondedichos anticuerpos son especificos para una molecule diana predeterminada que active la actividad de transducciande serial de una proteina de una superficie celular o de un receptor de reconocimiento de patrones, o sonespecificos para un antagonista de dicha molecule diana predeterminada donde dicho metodo comprende:preparaci6n de una diluciOn seriada de la muestra;

la adician a cada dilucion de una cantidad fija de la molecule diana, donde dicha cantidad se correspondecon una unidad de actividad predeterminada de la molecule diana, y donde la concentraci6n de moleculediana es la misma en cada dilucien;

la realized& de un ensayo con genes reporteros a cada una de las diluciones para determinar a cantidadde actividad residual de la molecule diana en cada dilucion, donde dicho ensayo con genes reporteroscomprende la medicien del nivel de un producto de genes reporteros cuando dicha dilucion entra encontacto con una linea celular transformada mediante una construcciOn que comprende una secuencia denucleotidos que codifican un producto del gen reportero, vinculado operativamente a uno o varioselementos de control transcripcional, que se regula por a actividad de transducciOn de serial de unaproteina de la superficie celular o de un receptor de reconocimiento de patrones en respuesta a una sealextracelular generada per dicha molecule diana; y

la determined& de la diluci& en la que la actividad de la molecule diana agregada se reduce un factorpredeterminado x, donde dicho titulo se expresa como una reduce& de x veces en unidades deactividad/ml,

donde la sensibilidad del ensayo de neutralized& aumenta, donde la linea celular usada en dicho ensayocon genes reporteros se ha tratado con un agente antimitatico o proapopt6tico para que adquierapropiedad de mantener dicha actividad de transduccion de serial durante al menos alrededor de una hora,aunque perdera dicha actividad e incurrira en muerte celular en un plazo no superior a 30 dias a unatemperature superior a la temperatura de congelacion.

Método de realización de un ensayo para neutralizar anticuerpos.

Sector de la técnica [0001] La presente invención se refiere a un ensayo de genes reporteros y un kit para determinar en una muestra la presencia y/o la cantidad de una molécula que desencadena la actividad de transducción de señal de una proteína de la superficie celular. La presente invención se refiere además a una célula que puede usarse en dicho ensayo ya un método de preparación de dicha célula.

Estado de la técnica

Las proteínas de la superficie celular permiten la transducción intracelular de señales extracelulares. Las proteínas de la superficie celular ofrecen a las células eucariotas y procariotas un medio para detectar señales extracelulares y transducirlas a nivel intracelular de una manera que resulte en una respuesta celular o una respuesta de un conjunto de tejido u órgano. Las proteínas de la superficie celular, al transmitir intracelularmente información acerca del medio extracelular a través de vías intracelulares específicas, inducen una respuesta adecuada a un estímulo determinado. Esta respuesta puede ser inmediata y transitoria, lenta y continuada, o una 20 combinación de ellas. Debido a un conjunto de variadas proteínas de la superficie de su membrana, las células eucariotas son enormemente sensibles a su entorno.

Las moléculas de señal extracelular, tales como las citoquinas, los factores de crecimiento, ciertas hormonas, los vasodilatadores y los neurotransmisores, ejercen sus efectos (al menos parcialmente) por medio de la interacción 25 con las proteínas de la superficie celular. Por ejemplo, algunas moléculas de señal extracelular causan cambios en la transcripción de los genes diana por medio de cambios en los niveles de mensajeros secundarios, tales como cAMP. Otras señales, al acflvar la expresión de los genes, indirectamente alteran la expresión de los genes, tales como los genes inmediatos-tempranos que codifican proteínas reguladoras que, a su vez, activan la expresión de otros genes codificadores de proteínas de regulación transcripcional. Otras moléculas de señal extracelular provocan la activación de transductores de señales citoplasmáticas latentes y de activadores de la proteína de transcripción (STAT) , que mejoran la transcripción de conjuntos específicos de genes.

Entre las proteínas de la superficie celular que responden a las señales extracelulares e inician los procesos que conducen a esta variada respuesta y expresión de los genes, se encuentran los receptores de la superticie celular y los canales iónicos. Los canales iónicos y los receptores localizados en la superficie celular son proteínas ubicuas y fisiológicamente importantes de la membrana de la superficie celular. Desempeñan un papel fundamental en la regulación de los niveles intracelulares de varios iones y sustancias químicas, muchos de los cuales Son importantes para la viabilidad y el funcionamiento celular.

Los receptores localizados en la superficie celular son proteínas transmembranafes que se unen a moléculas de señal extracelular o que detectan cambios en el medio extracelular y transmiten la señal a través de vías de transducción de señales para generar una respuesta celular. Los receptores de la superficie celular se unen a moléculas de señal circulantes, tales como citoquinas, factores de crecimiento y hormonas, etc., como paso inicial en la activación de numerosas vías intracelulares. Los receptores se clasifican según criterios estructurales o en función del tipo determinado de vía que se induce. Entre estas clases de receptores existen clases de receptores de citoquinas que incluyen aquellos que se unen a factores de crecimiento y presentan una actividad intrínseca de tirosina quinasa, tales como los receptores del factor de crecimiento de unión a heparina (HBGF) , la superfamilia de receptores de inmunoglobulinas, la superfamilia de receptores de citoquinas/hematopoyetinas, la superfamilia de receptores de factores de crecimiento nervioso, otros receptores de tirosina o serina quinasa, y aquellos que se acoplan a proteínas efectoras a través de proteínas de regulación de unión a nucleótidos de guanina, denominados respectivamente receptores acoplados a proteinas G y proteínas G.

Las citoquinas son mensajeros intercelulares que coordinan la comunicación entre las células de un tejido concreto (por ejemplo, las interacciones entre anticuerpos y células T del sistema inmunitaria) y sirven para modular

o modificar la respuesta biológica. Son pleiotrópicas y tienen un amplio espectro de efectos en más de un tipo de célula o tejido. Los receptores para citoquinas se agrupan genéricamente en dos clases, donde los receptores de la Clase I ﾭ

15) , a la eritropoyetina (EPO) , a la hormona del crecimiento (GH) , al factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) , al factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF) , al factor inhibitorio de leucemia (UF) , y el factor neurotrófico ciliar (CNTF) , el TNFa, el TGF y el ligando Fas, y los receptores para citoquinas de la Clase II inCluyen receptores que se unen al interlerán (IFN) oJ, IFNy Y a la IL-10.

comodescribe el presente documento, la vinculaciOn operative hace referencia a la vinculacian de un elemento de control transcripcional, i.e. un promotor, con una secuencia de codificaciOn de nucleetidos, de modo que este elemento se posiciona de forma adecuada para desempear su actividad, consistente en unir la ARN polimerasa e iniciar la transcripcion de la secuencia de codificacien de nucleotides. Asi, una secuencia de codificacion de nucleotides en vinculacion operative con un promotor se sitea en sentido descendente respecto a la direccien de la transcripcion desde el promotor, este en el marco de lecture correcto respecto al sitio de inicio de la transcripciOn, y se inserta de modo que la clanged& de la transcripción proceda a eaves de la secuencia de codificaciOn de nucleotides.

Los elementos de control transcripcional adecuados pueden obtenerse o derivarse de las regiones

reguladoras transcripcionales de los genes cuya expresion se induce de forma tide, por lo general on tan solo unos minutes a partir del momento en quo se produce el contacto entre el receptor de reconocimiento de patrones o la proteina de la superficie celular, y la proteina efectora que module la actividad del receptor de reconocimiento de patrones o la protefna de la superficie celular. Entre estos genes se incluyen los genes inmediatos tempranos (Sheng et al., 1990) , por ejemplo c-fos. Estos genes se inducen rapidamente cuando un ligando se une a una

proteina de la superficie celular. Entre los elementos de control transcripcional preferidos para las construcciones de genes reporteros se encuentran los correspondientes a los genes inmediatos tempranos, los elementos derivados de otros genes quo presentan parcial o completamente las caracteristicas de los genes inmediatos tempranos, o elementos sinteticos quo se construyen de modo quo los genes que mantienen con ellos una vinculacien operative presentan estas caracteristicas. Los genes preferidos desde los quo se derivan los elementos de control

transcripcional presentan, entre otras, las siguientes caracteristicas: expresien baja o indetectable en las celulas pasivas, induccien rapida a nivel transcripcional on cuestion de minutos a partir de la estimulacien extracelular, induce& transitoria e independiente de la sintesis de nuevas proteinas, la interrupciOn subsiguiente de la transcripcien precisa la sintesis de nuevas proteinas, y los mRNA transcritos desde estos genes tienen una vide media corta. No es necesario que estOn presentes todas estas propiedades.

Entre los elementos de control transcripcional y promotores adecuados se encuentran los promotores del gen de peptide intestinal vasoactivo (VIP) (receptive a cAMP. Fink et al., 1988) , del gen de la somatostatina (receptivo a cAMP. Montminy et al., 1986) , de la proeneefalina (receptive a cAMP, los agonistas nicotinicos y los esteres de forbol. Comb et al. 1986) , del gen de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (receptivo a cAMP. Short et al., 1986) , del

gen NGFI-A (receptive a NGF, cAMP y suero. Changelian et al., 1989) , los elementos de control transcripcional obtenidos o derivados del gen c-fos, y cualquier otro elemento que los expertos en a materia conozcan o consideren adecuado preparar.

El protooncogen c-fos es el homelogo celular del gen transformador del virus del osteosarcoma FBJ. Codifica una

proteina nuclear que con gran probabilidad forma parte de los procesos normales de diferenciación y crecimiento celular. La transcripcion de c-fos se active rapida y transitoriamente a eaves de factores de crecimiento... [Seguir leyendo]

1. Un método para realizar un ensayo de neutralización para el título de los anticuerpos en una muestra, donde dichos anticuerpos son específicos para una molécula diana predeterminada que activa la actividad de transducción de señal de una proteína de una superficie celular o de un receptor de reconocimiento de patrones, o son específicos para un antagonista de dicha molécula diana predeterminada, donde dicho método comprende:

la preparación de una dilución seriada de la muestra; la adición a cada dilución de una cantidad fija de la molécula diana, donde dicha cantidad se corresponde con una unidad de actividad predeterminada de la molécula diana, y donde la concentración de molécula diana es la misma en cada dilución; la realización de un ensayo con genes reporteros a cada una de las diluciones para determinar la cantidad de actividad residual de la molécula diana en cada dilución, donde dicho ensayo con genes reporteros comprende la medición del nivel de un producto de genes reporteros cuando dicha dilución entra en contacto con una línea celular transformada mediante una construcción que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican un producto del gen reportero, vinculado operativamente a uno o varios elementos de control transcripcional, que se regula por la actividad de transducción de señal de una proteína de la superficie celular o de un receptor de reconocimiento de patrones en respuesta a una señal extracelular generada por dicha molécula diana; y la determinación de la dilución en la que la actividad de la molécula diana agregada se reduce un factor predeterminado x, donde dicho título se expresa como una reducción de x veces en unidades de actividad/mi, donde la sensibilidad del ensayo de neutralización aumenta, donde la línea celular usada en dicho ensayo con genes reporteros se ha tratado con un agente antimitótico o proapoptótico para que adquiera la propiedad de mantener dicha actividad de transducción de señal durante al menos alrededor de una hora, aunque perderá dicha actividad e incurrirá en muerte celular en un plazo no superior a 30 días a una temperatura superior a la temperatura de congelación.

2. El método según la reivindicación 1, donde dicha línea celular tratada, sustancialmente de manera inmediata tras el tratamiento, se ha resuspendido en una solución que contiene un crioconservante, se ha congelado aproximadamente a _800 e y posteriormente se ha descongelado antes de su uso en dicho ensayo con genes reporteros.

3. El método según la reivindicación 2, donde dicho crioconservante es dimetilsulfóxido (DMSO) y dicha solución contiene un 10% de DMSO.

4. El método según la reivindicación 2, donde dicho crioconservante es una combinación de un 2, 5% de dimetilsulfóxido (DMSQ) y un 10% de glicerol.

5. El método según la reivindicaciones 1 a 4, donde dicho agente antimitótico O proapoptótico es vinblastina.

6. El método según las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho agente antimitótico O proapoptótico es 5-fluorouracilo.

7. El método según las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho agente antimitótico o proapoptótico es mitomicina e, un agente intercalante antitumoral.

8. El método según las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho agente antimitótico O proapoptótico es una radiación y, y donde dicha línea celular ha sido irradiada con radiación y a una intensidad y durante un tiempo suficientes para mantener dicha actividad de transducción de señal durante al menos 1 hora, aunque pierde dicha actividad e incurre en muerte celular en un plazo no superior a 30 días a una temperatura superior a la temperatura de congelación.

9. El método según las reivindicaciones 1 a 8, donde dicha proteína de la superficie celular es un receptor de superficie celular.

10. El método según la reivindicación 9, donde dicho receptor de la superficie celular se selecciona de un grupo compuesto por un receptor de citoquinas, un receptor de factores de crecimiento, un receptor de hormonas, un neurorreceptor, un receptor de células T, un receptor de antígenos, y un receptor complementario.

11. El método según la reivindicación 9, donde dicho receptor de la superficie celular es un receptor de interferón de Tipo 1, y dicha señal extracelular es proporcionada por un interferón de Tipo I como la molécula diana predeterminada.

12. El método según la reivindicación 11, donde la molécula diana predeterminada es un interferón o.

13. El método según la reivindicación 11, donde la molécula diana predeterminada es un interferón 13.