Liposomas con anticuerpos contra marcadores de la zona peri-infarto cerebral.

La invención se refiere a liposomas, marcados con una sustancia fluorófora como la rodamina o con un agente de resonancia magnética como el gadolinio, que incorporan en su superficie un anticuerpo dirigido contra la proteína de choque térmico HSP70, unido al liposoma por un resto maleimida, y que incorporan también en su composición PEG para aumentar su estabilidad y evitar respuestas inmunes. Dichos liposomas que acumulan en las células que sobreexpresan la proteína HSP70, por lo que pueden utilizarse para identificar dichas células, incluidas las que forman parte de la región peri-infarto cerebral, en la que se sobreexpresa dicha proteína. Los liposomas con gadolinio pueden también utilizarse en un procedimiento para obtener imágenes del cerebro por resonancia magnética a partir de las cuales se puede determinar la región peri-infarto, que será aquella en la que se acumulará más gadolinio (mayor contraste).

Liposomas con anticuerpos contra marcadores de la zona peri-infarto cerebral.

CAMPO TÉCNICO

La invención se refiere al campo de la Biotecnología, particularmente dirigida a la identificación y aplicación de marcadores de tejidos. Más concretamente, la invención se refiere a liposomas que presentan en su superficie anticuerpos dirigidos contra proteínas que se expresan en la zona peri-infarto y a la utilización de los mismos para la identificación de dicha región, tanto a partir de imágenes tomadas de pacientes como en muestras de tejido cerebral procesadas in vitro.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se denomina ictus a la pérdida de las funciones cerebrales como resultado de la interrupción del flujo sanguíneo al cerebro. Según su etiología, los ictus tienen dos variantes: isquémicos y hemorrágicos.

El ictus isquémico, también llamado infarto cerebral o isquemia cerebral, se debe a la oclusión de alguna de las arterias que irrigan la masa encefálica, bien sea por arteroesclerosis o bien por la presencia de un émbolo (embolia cerebral) que procede de otra localización.

El ictus hemorrágico (también conocido como hemorragia cerebral o apoplejía) , se debe a la ruptura de un vaso sanguíneo encefálico, ruptura que tiene como causas más frecuentes una elevación de la presión sanguínea o un aneurisma congénito. La hemorragia, además de privar de riego al área cerebral dependiente del vaso sanguíneo afectado, provoca también que la sangre extravasada comprima las estructuras cerebrales, afectando con ello a su funcionalidad e, incluso, a su viabilidad.

El ictus se están convirtiendo en una de las principales causas de muerte e incapacidad en los países desarrollados. Debido al progresivo envejecimiento de la población y los hábitos de vida, su incidencia está incrementándose en dichos países. Los avances sobre su tratamiento, en cambio, no van parejos.

Hasta ahora, el único tratamiento que ha demostrado ser eficaz contra la isquemia cerebral es la trombólisis pero, desgraciadamente, los tratamientos trombolíticos presentan un riesgo importante de empeorar el estado del paciente e, incluso, de provocarle la muerte, por lo que su uso se limita en la actualidad a una fracción reducida de pacientes (menor del 3%) (Kleindorfer et al., 2009) . Ante esta circunstancia, los neurólogos se ven obligados a tomar la decisión de aplicar o no el tratamiento trombolítico en función de la relación riesgo/beneficio que ello supondría.

Uno de los criterios más utilizados para evaluar esa relación riesgo/beneficio es la determinación del tamaño de la llamada "zona peri-infarto". Se llama así a la zona de tejido que está adyacente al núcleo de la lesión y que se considera tejido que, aunque está en riesgo, es potencialmente recuperable, siendo posible inducir en el mismo procesos de neuroprotección y neurorreparación, en contraposición a lo que sucede con el tejido isquémico adyacente (núcleo isquémico) , que es tejido ya muerto, básicamente irrecuperable. Si la zona de tejido "salvable" (la zona peri-infarto) es muy pequeña, lo normal es no aplicar el tratamiento trombolítico, porque los riesgos superan el beneficio. Cuando las dimensiones de la zona peri-infarto van siendo mayores, se considera que merece la pena correr los riesgos asociados a los tratamientos trombolíticos.

Así, la correcta identificación de la zona peri-infarto y la determinación de su tamaño resulta ser muy importante para tomar una decisión adecuada sobre la aplicación de tratamientos trombolíticos.

En la actualidad, sin embargo, las decisiones respecto al tratamiento se están tomando a partir de la aplicación de técnicas de neuroimagen en las que no se determina la zona peri-infarto, sino la llamada "zona de penumbra", zona que en ocasiones se asocia con la zona peri-infarto pero que no es exactamente lo mismo y que, en muchas ocasiones, no indica la extensión real del tejido potencialmente recuperable. El concepto de penumbra responde a una zona que tiene una rápida caducidad en el tiempo, apareciendo al tiempo que el tejido isquémico y desapareciendo a las pocas horas, bien porque pase a formar parte de la lesión total final o porque se haya recuperado, convirtiéndose en tejido viable. El concepto, efectivamente, responde a la práctica de efectuar estudios radiológicos a pacientes ingresados en urgencias durante las primeras horas (1 a 6 horas, por ejemplo) posteriores al infarto cerebral. En primer lugar, se recurre a técnicas de tomografía computerizada (TC) cerebral, para confirmar que se trata de un ictus; posteriormente, durante la exploración que sigue, se decide si procede o no hacer una resonancia. Si se considera conveniente, se aplican entonces técnicas de resonancia magnética (RM) craneal en las que se comparan las imágenes obtenidas mediante RM de perfusión (PWI) y RM de difusión (DWI) .

La RM de difusión proporciona imágenes basadas en la valoración de la difusión protónica en el agua del cerebro y, en general, se considera que permite detectar la zona de tejido denominada núcleo del infarto, con lesiones irreversibles. La RM de perfusión, por su parte, se basa en el efecto que produce la administración por vía intravenosa de contraste paramagnético durante su primer paso por la red capilar parenquimatosa cerebral, que es proporcional al volumen sanguíneo cerebral y que permite crear distintos mapas de perfusión, siendo los más utilizados los de tiempo de tránsito medio (MTT) o de tiempo hasta pico (TTP) , por su gran sensibilidad para detectar regiones cerebrales hipoperfundidas tras una oclusión vascular. Pero la principal aplicación clínica de la RM de perfusión se basa en su capacidad para identificar tejido isquémico potencialmente viable cuando se combina con RM de difusión pues dentro de las primeras horas de evolución del ictus, una gran proporción de pacientes con una oclusión arterial aguda presenta un volvumen de tejido hipoperfundido, detectable por RM de perfusión, mayor que el volumen de la lesión detectada mediante RM de difusión (Schellinger et al., 2001) . Esta diferencia o desacoplamiento entre ambos volúmenes se conoce con el término de desacoplamiento (mismatch) DWI-PWI, y representa un región con hipoperfusión crítica (alteración de los resultados de RM de perfusión) , pero sin edema citotóxico (RM de difusión normal) . El mismatch DWI-PWI es lo que se asocia con la penumbra isquémica, es decir, tejido en riesgo pero potencialmente recuperable mediante tratamientos de reperfusión.

Dicha zona de penumbra se asocia a menudo con la zona peri-infarto, pero no es exactamente lo mismo, entre otras razones, porque la zona de penumbra muchas veces no indica la extensión real del tejido conocido como "salvable". Además, el concepto de penumbra, como se ha apuntado previamente, responde a una zona que tiene una rápida caducidad en el tiempo, apareciendo al tiempo que el tejido isquémico y desapareciendo a las pocas horas, recuperándose para convertirse en tejido viable o pasando a formar parte de la lesión total final, mientras que la zona peri-infarto existiría en un paciente que hubiera padecido un infarto cerebral horas, e incluso días después de haber desaparecido la zona de penumbra.

Por todo ello, se ha pensado que sería más adecuado definir la zona peri-infarto mediante marcadores moleculares. Sin embargo, los estudios encaminados a conocer las particularidades de la zona peri-infarto y a la determinación de marcadores moleculares característicos presentes en ella está tropezando también con dificultades metodológicas. Las metodologías actuales de identificación histológica de la zona peri-infarto en muestras de tejido cerebral implica un procesado de las muestras que podría afectar a la integridad del tejido para posteriores técnicas de procesado. Esto es especialmente importante en los estudios de proteómica, en los que el tratamiento del tejido podría afectar a las proteínas presentes en el mismo, dificultando su extracción y análisis posterior, razón por la cual en los estudios proteómicos realizados, por ejemplo, en muestras de tejido cerebral extraídas de modelos animales, la zona peri-infarto se define previamente como el tejido que rodea la zona de infarto a una cierta distancia arbitraria del mismo (los 2 mm adyacentes al tejido, por ejemplo) . Esa estrategia deja un margen de incertidumbre importante respecto a que el tejido analizado corresponda totalmente a la zona peri-infarto o si realmente dicha región se extiende más allá o es más reducida.

Las técnicas inmunohistoquímicas actuales,... [Seguir leyendo]

1. Un liposoma basado en 1, 2-Diestearoil-sn-Glicero-3-fosfocolina (DSPC) , colesterol, 1, 2-Diestearoil-snGlicero-3-fosfetranolamina-N-[Metoxi (polietilenglicol) -2000] (PEG2000-DSPE) y maleimida-PEG2000-DSPE, caracterizado porque el liposoma presenta anticuerpos dirigidos contra la proteína de choque térmico de 70 kDa (anti-HSP70) unidos al liposoma por el grupo maleimida.

2. Liposoma según la reivindicación 1, en el que las proporciones molares entre DSPC y colesterol varían entre 2, 5:1 y 1, 5:1.

3. Liposoma según la reivindicación 2, en el que la proporción molar del total de fosfolípidos con PEG2000-DSPE en su composición varía entre 0, 05:1 y 0, 25:1.

4. Liposoma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la proporción DSPC:colesterol:PEG2000-DSPE es 0, 62:0, 33:0, 05.

5. Liposoma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la maleimida-PEG2000-DSPE está en una proporción 2, 5% molar respecto al total de fosfolípidos con PEG2000-DSPE.

6. Liposoma según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, cuyo diámetro está en el intervalo de 45 a 450 nm.

7. Liposoma según la reivindicación 6, cuyo diámetro está en el intervalo de 90 a 140 nm.

8. Liposoma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende fosfolípidos que llevan unido un compuesto fluoróforo.

9. Liposoma según la reivindicación 8, en el que el compuesto fluoróforo es rodamina.

10. Liposoma según la reivindicación 8 ó 9, que comprende 1, 2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfoetanolamina-N (Lisamina Rodamina B Sulfonilo) (rodamina-PE) .

11. Liposoma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende fosfolípidos que comprenden una sal de gadolinio.

12. Liposoma según la reivindicación 11, que comprende la sal del ácido dietilenetriaminopentaacético a, mbis (8-estearoilamido-3, 6-dioxaoctilamide) gadolinio (Gd-DTPA-SADA) o bien, la sal de gadolinio del ácido 1, 2-dimiristoilsn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-dietilentriaminopentaacético (PE-DTPA-Gd) .

13. Liposoma según las reivindicaciones 10 y/o 12, que comprende 1, 2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3fosfoetanolamina-N- (Lisamina Rodamina B Sulfonilo) (rodamina-PE) y la sal de gadolinio del ácido 1, 2-dimiristoil-snglicero-3-fosfoetanolamina-N-dietilentriaminopentaacético (PE-DTPA-Gd) .

14. Uso de los liposomas de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 para la identificación in vitro de células en las que la proteína HSP70 está sobreexpresada.

15. Uso según la reivindicación 14, en el que los liposomas comprenden fosfolípidos que comprenden un compuesto fluoróforo y en el que las células en las que la proteína HSP70 está sobreexpresada se identifican con las células en las que la señal de fluorescencia del fluoróforo comprendido en los liposomas es superior a la señal del resto de las células presentes en la muestra, tras haber puesto en contacto todas las células de la muestra con los liposomas.

16. Uso según la reivindicación 14, en el que los liposomas comprenden fosfolípidos que comprenden una sal de gadolinio y las células en las que HSP70 está sobreexpresada se identifican con las células que presentan los menores tiempos de relajación tras haber puesto en contacto las células con los liposomas y al hacer un estudio de resonancia magnética de la muestra.

17. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que las células en las que la proteína HSP70 está sobreexpresada son células presentes en una muestra de tejido cerebral.

18. Uso según la reivindicación 17, en el que se identifica la región peri-infarto como la región de la muestra de tejido cerebral en la que las que la proteína HSP70 está sobreexpresada.

19. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18; en el que las células se ponen en contacto con los liposomas incubando in vitro las células con los liposomas.

20. Uso según la reivindicación 19, en el que las células se incuban con los liposomas entre 10 minutos y 1 hora.

21. Uso según la reivindicación 17 ó 18, en el que las células se ponen en contacto con los liposomas inyectando los liposomas al animal en el que están presentes las células previamente a la toma de una muestra de tejido en la que están presentes dichas células, determinándose posteriormente in vitro tras haber extraído la muestra de tejido del individuo, las células en las que la proteína HSP70 está sobreexpresada.

22. Un método para la determinación de la región peri-infarto de un individuo a partir de neuroimágenes de resonancia magnética que comprende las siguientes etapas:

a) suministrar al individuo una composición que comprende liposomas de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13;

b) obtener imágenes de resonancia magnética del cerebro del individuo;

c) identificar como región peri-infarto la región de las neuroimágenes que corresponda a los tiempos de relajación T1 más bajos.

23. Método según la reivindicación 22, en el que la composición que comprende liposomas se administra por vía sistémica