ADN POLIMERASA TERMOESTABLE DEL AMPULLAVIRUS DE ARQUEAS ABV Y SUS APLICACIONES.

ADN polimerasa aislada seleccionada de entre el grupo de polipéptidos constituido por:

a) el polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 1; b) un fragmento de a) que presenta una actividad ADN polimerasa; c) un polipéptido que comprende por lo menos los fragmentos de SEC ID nº: 1 que permiten la actividad ADN polimerasa de dicha ADN polimerasa de a); d) un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 1 en la que los siguientes sitios de exonucleasa tal como se identifican en la figura 4: Exo I: ---I---DLET---, Exo II: -Y-HNL-FD---FIL, y/o Exo III: KE---YL--D---L, se han mutado o delecionado con el fin de que el polipéptido de ADN polimerasa resultante presente una actividad exonucleasa no detectable o deficiente en comparación con el polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 1; e) un polipéptido que presenta una secuencia que presenta por lo menos 80% de identidad tras la alineación óptima con la secuencia SEC ID nº: 1, presentando dicho polipéptido una actividad ADN polimerasa

La presente invención se refiere a la proteína ADN polimerasa termoestable del ampullavirus de arqueas ABV (virus con forma de botella de Acidianus) y al ácido nucleico que codifica para dicha ADN polimerasa. La invención se refiere asimismo a un procedimiento de síntesis, amplificación o secuenciación de ácido nucleico que implementa dicha proteína ADN polimerasa y a un kit o aparato que comprende dicha 5 proteína ADN polimerasa.

Los virus de ADN bicatenario (bc) de Crenarchaeota hipertermófilas presentan estructuras de genoma y morfotipos notablemente diversos y, basándose en estas propiedades, varios se han asignado ya a seis nuevas familias virales: Fuselloviridae con forma de huso, Lipothrixviridae filamentoso, Rudiviridae con forma de varilla, Guttaviridae con forma de gotita, Globuloviridae esférico y Bicaudaviridae con dos colas 10 (revisado en Prangishvili et al., 2001; Prangishvili y Garrett, 2004, 2005). Se descubrió recientemente un nuevo virus que presentaba una morfología con forma de botella única y se asignó provisionalmente a una nueva familia, la Ampullaviridae (Häring et al., 2005a).

Una variedad de técnicas de amplificación de ácido nucleico, desarrolladas como herramientas para la manipulación y el análisis de ácido nucleico, se han aplicado satisfactoriamente para el diagnóstico clínico 15 de enfermedades genéticas e infecciosas. Las técnicas de amplificación pueden agruparse en las que requieren ciclos de temperatura (PCR y reacción en cadena de la ligasa) y sistemas isotérmicos (sistemas de amplificación (3SR y NASBA), amplificación por desplazamiento de cadena y sistemas de replicación Q). Dos aspectos son advertencias frecuentes en estos procedimientos: la fidelidad de la síntesis y la longitud del producto amplificado. 20

El desarrollo de un sistema de amplificación que se basa en el mecanismo de replicación del ADN del fago phi29 (Φ29) ha sido objeto de publicaciones y documentos de patente (Dean et al., Genome Res. Junio de 2001;11 (6):1095-9; Mendez et al., EMBO J. 1997 1;16(9):2519-27; Hutchison et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(48):17332-6; Mamone, Innovations Forum: GenomiPhi DNA amplification, Life Sciences News 14, 2003 Amersham Biosciences; Blanco et al., 1994; documento EP 0 862 656 o patente US nº 5.001.050). 25

La ADN polimerasa de phi29 es una polimerasa altamente procesiva que se caracteriza por una fuerte actividad de desplazamiento de cadena que permite una amplificación de ADN isotérmica altamente eficaz (Blanco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5325-5329, 1984 y J. Biol.Chem., 264, 8935-8940, 1989). La ADN polimerasa de phi29 también posee actividad exonucleasa 3'=>5' (corrección de lectura) que actúa preferentemente sobre ADN monocatenario (Garmendia J. Biol.Chem., 267, 2594-2599, 1992). 30

Entre sus características, se pueden mencionar su actividad de desplazamiento de cadena y procesividad máximas entre las ADN polimerasas conocidas - pueden sintetizarse tramos de ADN de más de 70 kb de longitud (Blanco et al., 1989), su síntesis de ADN altamente precisa (Esteban et al., J. Biol. Chem., 268, 4, 2719-2726, 1993), sus altos rendimientos de ADN amplificado incluso a partir de cantidades minúsculas de molde y los productos de amplificación pueden utilizarse directamente en aplicaciones 35 posteriores (PCR, digestión por restricción, genotipado de SNP, etc.). Se desarrollaron numerosas aplicaciones específicas implementando esta ADN polimerasa particular tales como amplificación por círculo rodante (ACR) (Lizardi et al., Nat. Genet., 19, 225-232, 1998; Dean et al., Genome Res., 11, 1095-1099, 2001; Baner et al., Nucleic Acids Res., 26, 5073-5078, 1998). Amplificación por desplazamiento múltiple (ADM) (Dean et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 5261-5266, 2002), amplificación no sesgada de preparación de 40 molde de ADN o genoma completo para secuenciación. Este sistema sería adecuado para una amplificación fiel de moléculas de ADN mayores de 70 kb (Blanco et al., 1989), en gran medida por encima del límite de tamaño obtenido con los sistemas de amplificación disponibles hasta la fecha. Este procedimiento de amplificación cebada por PT isotérmica (“PT” significa proteína terminal) se aprovecharía de las propiedades particulares de la ADN polimerasa de phi29: (1) capacidad para utilizar una proteína como cebador, (ii) alta 45 procesividad intrínseca (>70 kb), y (iii) desplazamiento de cadena acoplado a la síntesis de ADN. La actividad específica de esta ADN polimerasa de phi29 se facilita para una temperatura de 30ºC y se precisa que esta ADN polimerasa de phi29 se inactive a 65ºC.

Actualmente, resulta necesaria una nueva ADN polimerasa que pertenezca a la familia de ADN polimerasas cebadas por proteína tales como ADN polimerasa de phi29 que puede funcionar a temperaturas 50 significativamente superiores a 30ºC y que no se inactiva completamente a 60ºC.

Puede mencionarse la patente US nº 5.198.543 (Blanco et al., 1993) que da a conocer una ADN polimerasa de Phi 29 que puede utilizarse en un procedimiento para determinar la secuencia de bases de nucleótidos de una molécula de ADN.

Puede mencionarse asimismo el documento Pecenkova et al. (J. Mol. Evol., 48:197-208, 1999) que estudia y analiza las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de proteínas y regiones de ADN seleccionadas del género de fagos de tipo Phi 29 con el fin de evaluar la filogenia del grupo de fagos, particularmente de regiones que codifican para ADN polimerasas y proteínas terminales.

Este es el objetivo de la presente invención. 5

Tras secuenciar y anotar la secuencia genómica completa del virus ABV (virus con forma de botella de Acidianus) que infecta a la arquea hipertermófila del género Acidianus, se ha demostrado una secuencia nucleica que codifica para una ADN polimerasa dependiente de ADN. De manera sorprendente, el análisis de la secuencia de proteína indicó que pertenece a la familia de ADN polimerasas cebadas por proteína. El gen para la ADN polimerasa se expresaba de manera heteróloga en E. coli y se ha confirmado la actividad de 10 polimerización de ADN de la proteína recombinante. Esta nueva enzima, similar a ADN polimerasas virales conocidas, es altamente procesiva y autosuficiente, sin requerir proteínas auxiliares. Debido a estas características, la enzima puede presentar ventajas significativas como herramienta para la amplificación de ADN mediante PCR. Al ser una enzima viral termoestable cebada por proteína, puede ser mucho más eficaz en la amplificación exponencial de ADN lineal mono o bicatenario (es decir, mediante el procedimiento 15 GenomiPhi desarrollado por Amersham) que la ADN polimerasa del bacteriófago Phi29, una enzima cebada por proteína mesófila, actualmente utilizada en este procedimiento. El kit de amplificación GenomiPhi de Amersham permite realizar pruebas de ADN ilimitadas a partir de un pequeño número de células o una cantidad limitada de muestra valiosa y es un procedimiento de amplificación de ADN genómico fácil que amplifica de manera representativa el genoma completo. 20

De este modo, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una ADN polimerasa aislada seleccionada de entre el grupo de polipéptidos constituido por:

a) el polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 1;

b) un fragmento de a) que presenta una actividad ADN polimerasa;

c) un polipéptido que comprende por lo menos los fragmentos de SEC ID nº: 1 que permiten la actividad 25 ADN polimerasa de dicha ADN polimerasa de a);

d) un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 1 en la que los sitios de exonucleasa Exo I, Exo II y/o Exo III tal como se identifican en la figura 4 se han mutado o delecionado para proporcionar un polipéptido de ADN polimerasa que presenta una actividad exonucleasa no detectable o deficiente en comparación con el polipéptido que presenta la secuencia 30 de aminoácidos de SEC ID nº: 1;

e) un polipéptido que presenta una secuencia que presenta por lo menos el 80% de identidad tras la alineación óptima con la secuencia SEC ID nº: 1, o tal como se define en de b) a d), presentando dicho polipéptido una actividad ADN polimerasa. Se da a conocer que dicho polipéptido presenta una actividad ADN polimerasa a una temperatura de 50ºC o superior a 50ºC. 35

En una forma de realización preferida, la ADN polimerasa según la invención se aísla del ampullavirus de arqueas ABV. Se da a conocer que dicha ADN polimerasa se...

1. ADN polimerasa aislada seleccionada de entre el grupo de polipéptidos constituido por:

a) el polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 1;

b) un fragmento de a) que presenta una actividad ADN polimerasa;

c) un polipéptido que comprende por lo menos los fragmentos de SEC ID nº: 1 que permiten la actividad 5 ADN polimerasa de dicha ADN polimerasa de a);

d) un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 1 en la que los siguientes sitios de exonucleasa tal como se identifican en la figura 4:

Exo I: ---I---DLET---,

Exo II: -Y-HNL-FD---FIL, y/o 10

Exo III: KE---YL--D---L,

se han mutado o delecionado con el fin de que el polipéptido de ADN polimerasa resultante presente una actividad exonucleasa no detectable o deficiente en comparación con el polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 1;

e) un polipéptido que presenta una secuencia que presenta por lo menos 80% de identidad tras la 15 alineación óptima con la secuencia SEC ID nº: 1, presentando dicho polipéptido una actividad ADN polimerasa.

2. ADN polimerasa según la reivindicación 1, que es aislada del ampullavirus de arqueas ABV.

3. ADN polimerasa según la reivindicación 1 ó 2, que comprende por lo menos los fragmentos siguientes de SEC ID nº: 1 tal como se identifican en la figura 4: 20

Pol I: YDVNSLYP-AM;

Pol IIa: --K---NS-YG;

Pol IIb: T---GR;

Pol III: Y-DTDS; y

Pol IV: K-Y. 25

4. Ácido nucleico que codifica para un polipéptido de ADN polimerasa según una de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 4.

6. Vector según la reivindicación 5, en el que dicho ácido nucleico está funcionalmente unido a un promotor. 30

7. Vector según la reivindicación 5, que ha sido depositado en la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, París, Francia) el 28 de abril de 2006 con el número I-3601.

8. Célula huésped que comprende el vector según las reivindicaciones 5 a 7.

9. Célula huésped según la reivindicación 8, que se ha depositado en la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, París, Francia) el 28 de abril de 2006 con el 35 número I-3601.

10. Procedimiento de producción de una ADN polimerasa, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) cultivar la célula huésped según la reivindicación 8 ó 9 en condiciones adecuadas para la expresión de dicho ácido nucleico; y

(b) aislar dicha ADN polimerasa de dicha célula huésped. 40

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha célula huésped es una célula procariota o una eucariota.

12. Procedimiento de síntesis de una molécula de ADN bicatenario que comprende:

(a) hibridar un cebador con una primera molécula de ADN; y

(b) incubar dicha molécula de ADN de la etapa (a) en presencia de uno o más desoxirribonucleósidos 5 trifosfato o análogos de los mismos y el polipéptido según las reivindicaciones 1 a 3, en condiciones suficientes para sintetizar una segunda molécula de ADN complementaria a la totalidad o parte de dicha primera molécula de ADN.

13. Procedimiento de síntesis de una molécula de ADN monocatenario que comprende:

(a) la síntesis de una molécula de ADN bicatenario mediante un procedimiento según la reivindicación 10 12; y

(b) desnaturalizar la molécula de ADN bicatenario obtenida en la etapa (a); y

(c) recuperar la molécula de ADN monocatenario obtenida en la etapa (b).

14. Procedimiento para la producción de moléculas de ADN de más de 10 kilobases de longitud que comprende los procedimientos según la reivindicación 12 ó 13, en el que la primera molécula de ADN: que 15 sirve como molde en la etapa (a) es de más de 10 kilobases.

15. Procedimiento según las reivindicaciones 12 a 14, en el que dichos desoxirribonucleósidos trifosfato se seleccionan de entre el grupo constituido por dATP, dCTP, dGTP y dTTP.

16. Procedimiento para amplificar una molécula de ADN bicatenario, que comprende:

(a) proporcionar unos primer y segundo cebadores, en el que dicho primer cebador es complementario a 20 una secuencia en o próxima a los extremos 3' terminales de la primera cadena de dicha molécula de ADN y dicho segundo cebador es complementario a una secuencia en o próxima a los extremos 3' terminales de la segunda cadena de dicha molécula de ADN;

(b) hibridar dicho primer cebador con dicha primera cadena y dicho segundo cebador con dicha segunda cadena en presencia del polipéptido según las reivindicaciones 1 a 3, en condiciones tales que se 25 sintetizan un ácido nucleico complementario a dicha primera cadena y un ácido nucleico complementario a dicha segunda cadena;

(c) desnaturalizar

- dicha primera cadena y sus cadenas complementarias; y

- dicha segunda cadena y sus cadenas complementarias; y 30

(d) repetir las etapas (a) a (c) una o más veces.

17. Procedimiento para determinar la secuencia de bases de nucleótidos de una molécula de ADN, que comprende las etapas que consisten en:

(a) poner en contacto dicha molécula de ADN con una molécula de cebador que puede hibridar con dicha molécula de ADN; 35

(b) incubar dicho híbrido formado en la etapa (a) en un recipiente que contiene cuatro desoxinucleósidos trifosfato diferentes, un polipéptido de ADN polimerasa según las reivindicaciones 1 a 3 y uno o más agentes de terminación de la síntesis de ADN que terminan la síntesis de ADN en una base de nucleótido específica, en el que dicho agente termina la síntesis de ADN en una base de nucleótido diferente; y 40

(c) separar los productos de ADN de la reacción de incubación según el tamaño, pudiéndose determinar por lo menos una parte de la secuencia de bases de nucleótidos de dicho ADN.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que dicho agente de terminación es un didesoxinucleósido trifosfato.

19. Procedimiento para la amplificación de una molécula de ADN que comprende las etapas que consisten en:

(a) incubar dicha molécula de ADN en presencia de un polipéptido que presenta ADN polimerasa según las reivindicaciones 1 a 3, la proteína terminal del ampullavirus de arqueas ABV y una mezcla de diferentes desoxinucleósidos trifosfato. 5

20. Procedimiento para la amplificación de una molécula de ADN según la reivindicación 19, en el que en un extremo de dicha molécula de ADN está covalentemente unido un fragmento que contiene el origen de replicación de dicho ABV.

21. Procedimiento según las reivindicaciones 10 a 20, en el que el polipéptido según las reivindicaciones 1 a 3 es un polipéptido como se ha definido en la reivindicación 1d) que presenta una 10 actividad exonucleasa deficiente y una actividad ADN polimerasa.

22. Kit para secuenciar una molécula de ADN, que comprende:

a) unos primeros medios de recipiente que comprenden el polipéptido según las reivindicaciones 1 a 3;

(b) unos segundos medios de recipiente que comprenden uno o más didesoxirribonucleósidos trifosfato; y 15

(c) unos terceros medios de recipiente que comprenden uno o más desoxirribonucleósidos trifosfato.

23. Kit para amplificar una molécula de ADN, que comprende:

(a) unos primeros medios de recipiente que comprenden el polipéptido según las reivindicaciones 1 a 3; y

(b) unos segundos medios de recipiente que comprenden uno o más desoxirribonucleósidos trifosfato. 20

24. Kit según la reivindicación 23, que comprende además una proteína terminal recombinante o aislada de ampullavirus de arqueas ABV que presenta la secuencia SEC ID nº: 3.

25. Kit según las reivindicaciones 22 a 24, en el que el polipéptido según las reivindicaciones 1 a 3 es un polipéptido como se ha definido en la reivindicación 1d) que presenta una actividad exonucleasa deficiente y una actividad ADN polimerasa. 25

26. Utilización de un polipéptido según las reivindicaciones 1 a 3 para amplificación por círculo rodante, amplificación por desplazamiento múltiple o amplificación cebada por proteínas.

27. Utilización según la reivindicación 26, en el que el polipéptido según las reivindicaciones 1 a 3 es un polipéptido como se ha definido en la reivindicación 1d) que presenta una actividad exonucleasa deficiente y una actividad ADN polimerasa. 30