Método de recogida y conservación de fluidos y/o materiales, en particular de fluidos orgánicos y/o materiales que contienen citoblastos, y dispositivo empleable en tal método.

Un método de recogida y conservación de fluidos orgánicos y/o materiales que contienen citoblastos,

comprendiendo dichos fluidos y/o materiales que comprenden un líquido amniótico y/o vellosidades coriónicas, que comprende las siguientes etapas:

- determinar un volumen de muestreo que está cerrado y/o separado del entorno externo;

- tomar una cantidad predeterminada de fluido y/o material que contiene citoblastos de dicho volumen de muestreo y confinar dicha cantidad predeterminada de fluido y/o material que contiene citoblastos en una muestra contenida/definida en un volumen de recogida; y

- conservar dicha muestra;

caracterizado porque:

- dicha etapa de tomar la cantidad predeterminada de fluido y/o material se realiza mientras se mantiene continuamente un aislamiento microbiológico, atmosférico y físico perfecto entre el volumen de muestreo y el volumen de recogida; y porque

- comprende además una etapa de manipular la muestra bajo condiciones de esterilidad en un aparato aislador, comprendiendo dicho aparato aislador:

- una cámara de trabajo aislada de un entorno externo y provista de un sistema de filtración, siendo un operario capaz de acceder a dicha cámara de trabajo por el uso de guantes adecuados que sobresalen del interior de la caja y conectados de forma sellada con una de las paredes de la cámara de trabajo, estando dicha cámara de trabajo presurizada a una mayor presión que la cámara de entrada;

- una cámara de entrada para la introducción de la muestra que va a procesarse, estando dicha cámara de entrada conectada a dicha cámara de trabajo y estando provista de esclusas que no permiten la comunicación directa entre la cámara de trabajo y dicho entorno externo;

- una cámara de salida conectada con la cámara de trabajo y que tiene una bolsa estéril de recogida de muestra, estando puesta dicha cámara de salida en comunicación con la cámara de trabajo por medio de esclusas; y

- medios de esterilización que actúan al menos sobre la cámara de trabajo y/o la cámara de entrada y/o la cámara de salida y adecuados para procesar la muestra y esterilizar una superficie externa del propio recipiente de la muestra, teniendo lugar un proceso de esterilización antes de cada etapa de trabajo y entre las operaciones para procesar dos muestras diferentes, y

- un aparato de refrigeración dispuesto dentro del aislador, siendo dicho aparato de refrigeración dispuesto dentro del aislador empleado para una sub-etapa de refrigerar la muestra bajo una temperatura de conservación predeterminada.

Método de recogida y conservación de fluidos y/o materiales, en particular de fluidos orgánicos y/o materiales que contienen citoblastos, y dispositivo empleable en tal método La presente invención se refiere a un método de recogida y conservación de fluidos y/o materiales que contienen citoblastos, siendo tal método empleable en diferentes campos de operación, tales como el muestreo y la conservación de fluidos orgánicos en el ámbito clínico/de laboratorio.

Se sabe que en diferentes campos de producción se hace necesario el muestreo de una sustancia fluida de un volumen cerrado dado, como puede ocurrir en ejemplos médicos prenatales, y también en cuanto a lo que se refiere al trabajo de algunos circuitos impresos electrónicos.

En el primero de los dos campos de aplicación mencionados anteriormente a modo de ejemplo, aunque están siendo realizadas pruebas tales como la amniocentesis y CVS (es decir, muestreo de vellosidades coriónicas) , se contempla una primera etapa en particular en la que un primer muestreo de líquido amniótico (aproximadamente 3 cm3) se lleva a cabo por medio de una jeringa adecuadamente dispuesta de manera que perfore la pared abdominal y la placenta de la mujer embarazada de la manera menos invasiva posible; posteriormente, mientras que la aguja se mantiene implantada durante el primer muestreo, el cuerpo de la jeringa se cambia con el fin de obtener un segundo muestreo más voluminoso (aproximadamente 10 cm3 del líquido amniótico) .

Generalmente, el líquido tomado durante el primer muestreo se desecha, esencialmente debido al hecho de que la inserción de la aguja a través de la pared abdominal y la placenta da lugar a la creación de un residuo sustancialmente cilíndrico del tejido orgánico de la madre (que en el campo particular normalmente se denomina "frústula" o "fragmento") , que obviamente interfiere con la calidad de la muestra de fluido y/o material tomado.

Sin embargo, debe señalarse que actualmente la técnica conocida no contempla ningún método que implique el uso a largo plazo de líquido amniótico o vellosidades coriónicas, sobre todo a propósito de la posibilidad de conservar, sacar y posteriormente manipular los citoblastos que pueden encontrarse suspensos en él.

Por el contrario, el segundo campo de aplicación mencionado anteriormente implica un método particular de imprimir circuitos electrónicos en los que se usa un gel particular que cubre la placa en trabajo (que a su vez se "mapea" por medio de un haz láser o similares) ; en este método, las características fisicoquímicas del gel afectan adversamente la conductividad de los circuitos electrónicos impresos por medio del haz láser (que pasa a través del propio gel) y es, por tanto, esencial que se lleven a cabo periódicamente muestras de gel con el fin de comprobar la composición de la misma.

En los ejemplos de aplicación brevemente descritos anteriormente (pero también en muchos otros campos de operación) es, por tanto, necesario operar sobre una sustancia dada que puede estar en el estado fluido y está adaptada para ser analizada/examinada; al mismo tiempo, esta sustancia va a mantenerse en un volumen de operación que debe aislarse en la medida de lo posible de agentes externos (atmósfera, entornos no estériles, sustancias extrañas, etc.) .

La técnica conocida que se acaba de describir, a pesar de ser bastante ampliamente extendida, tiene algunos inconvenientes.

Primero, la ejecución de métodos conocidos para el muestreo de fluidos y/o materiales (de naturaleza orgánica o no orgánica) está altamente expuesta a riesgos de contaminación de las muestras tomadas, con todas las consecuencias negativas resultantes de la misma.

Además, refiriéndose en particular a fluidos orgánicos y/o materiales que contienen citoblastos, debe señalarse que la implementación de un método que permite una recogida y conservación eficaz y precisa de los mismos es hasta ahora desconocida, ni se sabe que sea un método que pueda asegurar las condiciones de sellado hermético y de esterilidad necesarias (o en cualquier caso las condiciones de máxima separación de agentes ambientales no deseables de naturaleza macro-o microscópica) para poner en práctica las técnicas de "trabajo" y manipulación que pueden (o podrían en el futuro) aplicarse a los propios citoblastos.

Además, con el uso de jeringas comunes, se requiere que el líquido recogido sea vertido de la jeringa verdadera en un recipiente adecuado para la almacenamiento y/o posterior análisis; sin embargo, esta transferencia intermedia puede exponer la muestra recogida a un contacto no deseable con el entorno de alrededor que puede conducir a contaminación y/o errores en el análisis.

Este inconveniente es particularmente grave en el campo clínico, ya que la posibilidad de romper el aislamiento entre el volumen de recogida de fluido y el entorno de alrededor puede producir la entrada de agentes patógenos en el fluido muestreado, pero sobre todo en el cuerpo del paciente; en el caso de pruebas prenatales, las

consecuencias pueden ser doblemente adversas, ya que pueden surgir patologías obviamente posibles tanto para la mujer embarazada como para el feto nonato.

Por otra parte, si se necesita conservación a largo plazo del fluido tomado, y en particular si se requiere la adición de sustancias conservantes adecuadas al fluido, una vez más las jeringas del tipo convencional no son capaces de llevar a cabo esta operación sin exponer la muestra tomada al entorno externo (que implica exponer el fluido a riesgos de contaminación) . Los documentos US 5000192, WO 90/13261 muestran ejemplos de dispositivos de muestreo para líquido amniótico.

En vista de lo anterior, la presente invención tiene como objetivo concebir un proceso que permita muestrear volúmenes de fluido y/o material muy precisos de una manera completamente segura (con relación a la contaminación externa) y más rápidamente que con métodos tradicionales.

Todavía más generalmente, la presente invención tiene como objetivo concebir un método que pueda muestrear y conservar fluidos orgánicos (tales como, por ejemplo, el líquido amniótico, y/o el material obtenido cuando se realiza un procedimiento de CVS) que contienen citoblastos, de manera que sea posible trabajar en los citoblastos contenidos en su interior y en un estado de conservación, incluso después de un periodo de almacenamiento indefinido.

Todavía con relación al método, la presente invención desea poner a disposición un proceso que permita la posible mezcla de sustancias conservantes con los fluidos muestreados y/o material, en un corto periodo de tiempo y con la mayor fiabilidad y exactitud (obviamente mientras que se observa completamente el requisito de aislarlos del entorno externo también durante la etapa de añadir el conservante) .

Los objetivos anteriores y adicionales se logran por un método de recogida y conservación de fluidos y/o materiales, en particular fluidos orgánicos y/o materiales que contienen citoblastos, además de por un dispositivo empleable en un método tal, según la presente invención, que tiene las características mostradas en las reivindicaciones adjuntas y en lo sucesivo ilustradas en una realización de la misma dada a modo de ejemplo no limitante.

Por tanto, desde el punto de visa de la operación, la presente invención contempla la implementación de un método de recogida y conservación de un fluido y/o un material (que puede ser de naturaleza orgánica, como en la realización del método descrito después, y que preferentemente contendrá una cierta cantidad de citoblastos) , que principalmente (pero no exclusivamente) comprende las siguientes etapas:

- en primer lugar, se determina un volumen de muestreo, que preferentemente se cerrará y/o separará del entorno de alrededor (tal como placenta de una mujer embarazada, o el interior de una botella de vino en maduración, etc.) ; -una vez determinado el volumen de muestreo sobre el que operar, se toma una cantidad predeterminada de fluido y/o material de este volumen de muestreo; y -esta cantidad predeterminada de fluido y/o material se confina en un volumen de recogida.

Ventajosamente, la determinación de la cantidad de fluido y/o material y la confinación de tal cantidad en el volumen de muestreo se llevan a cabo simultáneamente, y además, estas dos etapas de operación son contemporáneas con una etapa de mantener el aislamiento hidráulico y/o neumático y/o microbiológico entre el volumen de muestreo y el volumen de recogida.

En este momento, se apreciará que existe una diferencia entre el método de la invención y el método de la técnica conocida; en realidad, mientras que en los métodos... [Seguir leyendo]

1. Un método de recogida y conservación de fluidos orgánicos y/o materiales que contienen citoblastos, comprendiendo dichos fluidos y/o materiales que comprenden un líquido amniótico y/o vellosidades coriónicas, que 5 comprende las siguientes etapas:

- determinar un volumen de muestreo que está cerrado y/o separado del entorno externo;

- tomar una cantidad predeterminada de fluido y/o material que contiene citoblastos de dicho volumen de muestreo y confinar dicha cantidad predeterminada de fluido y/o material que contiene citoblastos en una muestra contenida/definida en un volumen de recogida; y -conservar dicha muestra;

caracterizado porque:

- dicha etapa de tomar la cantidad predeterminada de fluido y/o material se realiza mientras se mantiene continuamente un aislamiento microbiológico, atmosférico y físico perfecto entre el volumen de muestreo y el volumen de recogida; y porque -comprende además una etapa de manipular la muestra bajo condiciones de esterilidad en un aparato aislador, comprendiendo dicho aparato aislador:

- una cámara de trabajo aislada de un entorno externo y provista de un sistema de filtración, siendo un operario capaz de acceder a dicha cámara de trabajo por el uso de guantes adecuados que sobresalen del interior de la caja y conectados de forma sellada con una de las paredes de la cámara de trabajo, estando dicha cámara de trabajo presurizada a una mayor presión que la cámara de entrada;

- una cámara de entrada para la introducción de la muestra que va a procesarse, estando dicha cámara de entrada conectada a dicha cámara de trabajo y estando provista de esclusas que no permiten la comunicación directa entre la cámara de trabajo y dicho entorno externo; -una cámara de salida conectada con la cámara de trabajo y que tiene una bolsa estéril de recogida de muestra, estando puesta dicha cámara de salida en comunicación con la cámara de trabajo por medio de esclusas; y -medios de esterilización que actúan al menos sobre la cámara de trabajo y/o la cámara de entrada y/o la cámara de salida y adecuados para procesar la muestra y esterilizar una superficie externa del propio recipiente de la muestra, teniendo lugar un proceso de esterilización antes de cada etapa de trabajo y entre las operaciones para procesar dos muestras diferentes, y -un aparato de refrigeración dispuesto dentro del aislador, siendo dicho aparato de refrigeración dispuesto dentro del aislador empleado para una sub-etapa de refrigerar la muestra bajo una temperatura de conservación predeterminada.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que dicha cantidad predeterminada de fluido y/o material que define la muestra comprende entre 1 y 10 cm3 y siendo preferentemente igual a 3 cm3.

3. Un método según la reivindicación 1, en el que dicho aislador también comprende un bloque térmico alojado dentro de la cámara de trabajo y adecuado para la pre-refrigeración de una disolución refrigerante.

4. Un método según la reivindicación 1, en el que dichos medios de esterilización son adecuados para la atomización de uno o más agentes esterilizantes, teniendo dicho proceso de esterilización preferentemente lugar por el uso de peróxido de hidrógeno introducido en el aislador.

5. Un método según la reivindicación 1, en el que comprende además una etapa de añadir el fluido y/o material que contiene citoblastos con 10% de DMSO (sulfóxido de dimetilo) .

6. Un método según la reivindicación 1, en el que comprende además una etapa de control continuo de parámetros del recuento de partículas y/o de recuento microbiológico.

7. Un método según la reivindicación 1, en el que comprende además una etapa de congelación de los citoblastos, comprendiendo dicha etapa las siguientes sub-etapas:

- tomar una cantidad de líquido amniótico y/o vellosidades coriónicas, obtenido mediante CVS (muestreo de vellosidades coriónicas) , siendo dicha cantidad igual a 2-2, 5 ml; -admitir dicha cantidad de líquido amniótico y/o vellosidades coriónicas en un recipiente, siendo dicho recipiente un tubo de ensayo de 15 ml con un fondo cónico y un tapón roscado; -insertar dicho tubo de ensayo en el aislador; -centrifugar dicha cantidad de un líquido amniótico y/o vellosidades coriónicas a 2000 rpm durante 10 minutos; y 65 -tomar un sobrenadante de dicho tubo de ensayo.

8. Un método según la reivindicación 1, en el que también está presente una etapa de conservar la muestra en recipientes de almacenamiento adecuados que contienen nitrógeno líquido.

9. Un método según la reivindicación 1, en el que comprende además una etapa de descongelar la muestra, comprendiendo dicha etapa las siguientes sub-etapas:

- tomar la muestra de nitrógeno líquido; -posicionar la muestra en hielo;

-llevar la muestra a un termostato a 37 ºC; -transferir la muestra al aislador después de dicha etapa de descongelación; -transferir la muestra gota a gota a un tubo de ensayo que tiene una capacidad de 15 ml, fondo cónico y tapón roscado y que contiene aproximadamente 9 ml de un medio de lavado; y -centrifugar dicho tubo de ensayo, después de una sub-etapa de extraer el tubo de ensayo del aislador a 1500 15 rpm durante 10 minutos.

10. Un método según la reivindicación 9, en el que también están presentes las siguientes etapas:

- posteriormente a la etapa de centrifugar un tubo de ensayo, insertar dicho tubo de ensayo en el aislador.

20. tomar un sobrenadante de dicho tubo de ensayo; -resuspender un sedimento de células contenido en dicho tubo de ensayo con una sustancia de crecimiento adecuada en una cantidad incluida entre 1 ml y 4 ml; y -transferir dicho sedimento de células y dicha sustancia de crecimiento a un matraz del tipo "T25".