Conversión microbiana de azúcares ácidos y medios útiles para ello.

Una molécula de ADN aislada que comprende un gen que codifica una proteína enzimática que convierte el ácido L-galactónico en ácido L-treo-3-desoxi-hexulosónico,

en la que dicho ADN codifica una proteína enzimática que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2.

Conversión microbiana de azúcares ácidos y medios útiles para ello Campo de la invención La presente invención se refiere a enzimas implicadas en la conversión de azúcares ácidos, y más concretamente, a una proteína enzimática y su uso y producción. También se refiere a moléculas de ADN que codifican dichas enzimas, y a moléculas de ADN genéticamente modificadas y a microorganismos que comprenden dicho ADN. La invención también se refiere a microorganismos genéticamente modificados, en los que el gen codificador de la enzima ha sido inactivado y al uso de dicho microorganismo.

Antecedentes de la invención Los residuos biológicos de la industria, incluyendo la agricultura, contienen azúcares y sus derivados, tales como azúcares ácidos. La conversión de dichos residuos en productos útiles ha suscitado interés y ha representado un reto en el campo de la biotecnología durante mucho tiempo. El ácido D-galacturónico es el principal componente de la pectina, una materia prima de bajo precio enriquecida, por ejemplo, en la pulpa de la remolacha azucarera, y una fuente de carbono para microorganismos que se alimentan de materia vegetal en descomposición.

En bacterias se conoce una vía que consiste en 5 enzimas que convierten el ácido D-galacturónico (Dgalacturonato) en piruvato y D-gliceraldehído 3-fosfato (figura 1) . Los metabolitos intermedios son D-tagaturonato, Daltronato, ácido D-eritro-3-desoxi-hexulosónico (2-ceto-3-desoxi D-gluconato) y ácido D-eritro-3-desoxi-hexulosónico 6-fosfato (2-ceto-3-desoxi D-gluconato 6-fosfato) . Las enzimas son uronato isomerasa (EC 5.3.1.12) , una Dtagaturonato reductasa que emplea NADH (EC 1.1.1.5) , altronato deshidratasa (EC 4.2.1.7) , 2-ceto-3-desoxi Dgluconatoquinasa (EC 2.7.1.45) y 2-ceto-3-desoxi D-gluconato 6-fosfatoaldolasa (EC 4.1.2.14) .

La vía de la figura 1 solo ha sido descrita para organismos procariotas, es decir, no existen informes acerca de una vía similar en microorganismos eucariotas. Debe existir una vía en los microorganismos eucariotas, puesto que muchas especies de levaduras y mohos pueden utilizar y crecen sobre el D-galacturonato, pero se sabe muy poco acerca de esta vía.

Solo existen alguns estudios sobre el catabolismo del ácido D-galacturónico en microorganismos eucariotas. Uitzetter et al., 1986 (J. Gen. Microbiol., 132, 1167-1172) mutagenizaron el hongo filamentoso Aspergillus nidulans y descubrieron que los mutantes que carecen de actividad piruvato deshidrogenasa o purivato carboxilasa son incapaces de crecer sobre D-galacturonato, mientras que un mutante de piruvato quinasa fue capaz de crecer sobre D-galacturonato. Se interpretó que esto indica que el D-galacturonato se convierte en piruvato pero no a través de fosfoenolpiruvato, es decir, esto sería similar al caso de las bacterias. Visser et al., 1988 (J. Gen. Microbiol., 134, 655-659) han especulado que, en A. nidulans, el ácido D-galacturónico se cataboliza a través de gliceraldehído y piruvato, lo cual se diferencia de la vía bacteriana en que las bacterias lo metabolizan a través de D-gliceraldehído 3fosfato. También se ha sugerido que el ácido D-galacturónico se metaboliza a través de glicerol, puesto que un mutante de glicerol quinasa presenta un menor crecimiento sobre ácido D-galacturónico (Witteveen, C.F. et al., 1990, J. Gen. Microbiol., 136, 1299-1305) , y una glicerol deshidrogenasa dependiente de NADP fue inducida por el ácido D-galacturónico (Sealy-Lewis, H.M. y Fairhurst, V., 1992, Curr. Genet., 22, 293-296) .

No existen informes sobre genes que sean similares a los genes de la vía del ácido D-galacturónico bacteriana, tal como se muestra en la figura 1, en el genoma de ningún microorganismo eucariota del cual se haya secuenciado el genoma. Esto sugiere que existe una vía eucariota para el catabolismo del ácido D-galacturónico que es diferente de la vía bacteriana.

En hongos, se ha sugerido que el ácido D-galacturónico es convertido en galactonato por una aldoceto reductasa, tras lo cual una deshidratasa o racemasa modifica el galactonato para producir 2-ceto-3-desoxigalactonato, y una aldolasa divide el 2-ceto-3-desoxigalactonato en piruvato y gliceraldehído. Martens-Uzunova, E. et al., (Fungal Genetics Newsletter, vol. 52, suplemento (185) , XXIII Fungal Genetics Conference, 15-20 de marzo, 2005, Pacific Grove, California) han identificado un agrupamiento de genes coexpresados que codifican la aldoceto reductasa, la racemasa y la aldolasa putativas necesarias. No se identificó ninguna deshidratasa, ni los autores explican el papel de la racemasa. De hecho, no mencionan si dicho galactonato o dicho 2-ceto-3-desoxigalactonato o dicho gliceraldehído están en la configuración L o D.

La presente invención se basa en el descubrimiento de un nuevo gen y una enzima implicada en el metabolismo fúngico del ácido D-galacturónico. Este descubrimiento revela una vía metabólica putativa del ácido D-galacturónico. El ADN que comprende el gen puede utilizarse para producir microorganismos genéticamente modificados que son capaces de fermentar, de forma eficaz, carbohidratos y sus derivados, tales como azúcares ácidos y sus derivados, a partir de un biomaterial para obtener productos de la fermentación útiles, tales como etanol.

Un objetivo de la invención es proporcionar una proteína enzimática, que puede ser expresada por un hospedante para la conversión de azúcares ácidos y sus derivados en productos de la conversión útiles en un medio de fermentación, o que está en forma de una preparación enzimática para la conversión in vitro de azúcares ácidos y

sus derivados en productos finales o productos intermedios útiles.

Otro objetivo de la invención es proporcionar un organismo genéticamente modificado en el que se evita la expresión del gen y que, por tanto, es capaz de acumular el sustrato de esta enzima.

La nueva molécula de ADN codifica una azúcar ácido deshidratasa que es activa sobre azúcares ácidos, en los que el grupo hidroxilo de C2 está en la la configuración L y el grupo hidroxilo de C3 está en la configuración D en la proyección de Fischer. La enzima no muestra actividad con azúcares ácidos en los que el grupo hidroxilo de C2 está en la la configuración D y el grupo hidroxilo de C3 está en la configuración L. Estas deshidratasas fueron previamente descritas, por ejemplo, en Niu et al. (J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 12998-12999) , que describe una deshidratasa que es activa sobre el ácido L-arabónico y el ácido D-xilónico. Otro ejemplo es la D-gluconato deshidratasa que es activa en la vía de Entner-Doudoroff no fosforilada (véase, por ejemplo, Buchanan et al., Biochem. J., 1999, 343, 563-570) .

En un extracto bruto de la bacteria Pseudomonas saccharophila se ha descubierto actividad enzimática conversora del ácido D-arabónico, y se cree que el producto de la reacción es el ácido 2-ceto-3-desoxi-D-arabónico (Palleroni,

N.J. y Doudoroff, M., 1956, J. Biol. Chem., 223:499-508) . Sin embargo, no se aisló ni se expresó ningún gen. El documento EP 1 496 113 describe una gluconato deshidrogenasa bacteriana y el gen codificador. La enzima es capaz de convertir el ácido D-galactónico y el ácido L-arabónico en ácido 2-ceto-3-desoxi-D-galactónico y el ácido 2ceto-3-desoxi-D-arabónico, respectivamente. Elshafei, A.M. et al., 1995, Antonie van Leeuwenhoek, vol. 67, n.º 2, pp. 211-216 describen la D-galactonato deshidratasa de Aspergillus terreus, que deshidrata el D-galactonato para producir 2-ceto-3-desoxi-D-galactonato. Ambas enzimas bacteriana y fúngica descritas deshidratan el Denantiómero del ácido galactónico.

Resumen de la invención La invención proporciona una molécula de ADN aislada que comprende un gen que codifica una proteína enzimática que convierte el ácido L-galactónico en ácido L-treo-3-desoxi-hexulosónico, en la que dicho ADN codifica una proteína enzimática que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:2.

La invención proporciona también una molécula de ADN genéticamente modificada, que es un vector que comprende dicha molécula de ADN, y un microorganismo hospedante que la contiene, y que es un microorganismo genéticamente modificado transformado con dicha molécula de ADN genéticamente modificada.

La invención también proporciona una proteína enzimática que convierte el ácido L-galactónico en ácido L-treo-3desoxi-hexulosónico y que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:2, y un método para producir dicha enzima mediante el cultivo del microorganismo hospedante bajo condiciones que permiten la expresión de dicha proteína, y la recuperación de la proteína enzimática.

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1. Una molécula de ADN aislada que comprende un gen que codifica una proteína enzimática que convierte el ácido L-galactónico en ácido L-treo-3-desoxi-hexulosónico, en la que dicho ADN codifica una proteína enzimática que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:2.

2. La molécula de ADN según la reivindicación 1, en la que dicho ADN codifica una proteína enzimática que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.

3. La molécula de ADN según la reivindicación 1, en la que dicho ADN codifica una ácido L-galactónico deshidratasa de origen fúngico.

4. La molécula de ADN según la reivindicación 1, en la que dicho gen comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:1.

5. La molécula de ADN según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse con SEQ ID NO:1 bajo condiciones intermedias o rigurosas.

6. Un vector que comprende la molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un microorganismo hospedante que contiene el vector de la reivindicación 6.

8. El microorganismo según la reivindicación 7, estando dicho microorganismo depositado con el n.º de registro DSM 17214.

9. Una proteína enzimática que convierte el ácido L-galactónico en ácido L-treo-3-desoxi-hexulosónico, en la que dicha proteína enzimática tiene al menos 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:2.

10. La proteína enzimática según la reivindicación 9 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.

11. La proteína enzimática según la reivindicación 9, en la que dicha proteína convierte también el ácido Darabónico en ácido D-glicero-3-desoxi-pentulosónico.

12. Un método para producir una proteína enzimática que convierte el el ácido L-galactónico en ácido L-treo-3desoxi-hexulosónico, comprendiendo dicho método cultivar el microorganismo de la reivindicación 7 bajo condiciones que permiten la expresión de dicha proteína, y recuperar la proteína enzimática.

13. Un método para convertir el ácido L-galactónico en ácido L-treo-3-desoxi-hexulosónico, que comprende poner en contacto el ácido L-galactónico con una proteína enzimática que tiene al menos 30% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:2.

14. Un método para producir un compuesto deseado a partir de biomasa que comprende un azúcar ácido o uno de sus derivados, comprendiendo dicho método las etapas de:

transformar un microorganismo hospedante con una molécula de ADN que comprende un gen que codifica una proteína enzimática que convierte el ácido L-galactónico en ácido L-treo-3-desoxi-hexulosónico;

fermentar dicha biomasa con el microorganismo transformado; y

recuperar el compuesto deseado producido.

15. El método según la reivindicación 14, que comprende fermentar la pulpa de la remolacha azucarera u otro material que comprende pectina, y recuperar de la fermentación etanol, ácido láctico u otros compuestos derivados del ácido pirúvico.

16. Un método para convertir el ácido D-arabónico en ácido D-glicero-3-desoxi-pentulosónico, que comprende poner en contacto el ácido D-arabónico con una proteína enzimática que tiene al menos 30% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:2.

17. El uso de una proteína enzimática según la reivindicación 9 para producir un compuesto deseado a partir de un material que comprende un azúcar ácido o uno de sus derivados.

18. Una preparación enzimática que comprende la proteína enzimática de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.

19. Una cepa de Hypocrea jecorina que está genéticamente modificada para inactivar el gen que codifica una proteína enzimática que convierte el ácido L-galactónico en ácido L-treo-3-desoxi-hexulosónico.

20. Un método para producir ácido L-galactónico proporcionando un microorganismo que tiene un gen que codifica una proteína enzimática que convierte el ácido L-galactónico en ácido L-treo-3-desoxi-hexulosónico, inactivando dicho gen, y utilizando el microorganismo genéticamente modificado obtenido para la producción de ácido Lgalactónico.

21. Un método para producir ácido D-arabónico proporcionando un microorganismo que tiene un gen que codifica una proteína enzimática que convierte el ácido L-galactónico en ácido L-treo-3-desoxi-hexulosónico, inactivando 5 dicho gen, y utilizando el microorganismo genéticamente modificado obtenido para la producción de ácido Darabónico.

22. Un método para modificar un microorganismo que tiene un gen que codifica una proteína enzimática que convierte el ácido L-galactónico en ácido L-treo-3-desoxi-hexulosónico, en el que dicho método comprende inactivar dicho gen.