SISTEMA DE CONTEO DE PARTÍCULAS ADAPTABLE A UN INSTRUMENTO ÓPTICO.

La invención describe un sistema de conteo microscópico, diseñado para el conteo de partículas,

en particular microorganismos, al microscopio o con una lupa. El sistema es adaptable a cualquier microscopio o lupa. Permite analizar muestras biológicas y/o partículas que previamente han sido preparadas para su observación e introducidas en una cámara de recuento u otro recipiente (cámara de Neubauer, cámara de Thoma, etc). Mediante un procedimiento propio de calibración, el sistema permite calcular de forma automática o semi-asistida la concentración celular (o de partículas) existente en la muestra de forma rápida y eficaz.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201131941.

Solicitante: CELEROMICS TECHNOLOGIES, S.L.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: BASTIDAS GARCIA,Oscar.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • G01N15/10 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 15/00 Investigación de características de partículas; Investigación de la permeabilidad, del volumen de los poros o del área superficial efectiva de los materiales porosos (identificación de microorganismos C12Q). › Investigación de partículas individuales.

Fragmento de la descripción:

5 SISTEMA DE CONTEO DE PARTICULAS ADAPTABLE A UN INSTRUMENTO ÓPTICO Campo técnico de la invención La presente invención se refiere al campo de conteo celular y de partículas. En particular, se refiere a los sistemas de conteo de células y partículas con microscopio o lupa. 10 Más concretamente, se refiere a los sistemas de conteo con microscopio o lupa basados en análisis de imagen que realizan un conteo automático, semi-automático o semi-asistido. 15 20 25 30 Estado de la Técnica Se conocen diversas técnicas antiguas de conteo celular como puede ser la divulgada por la patente US-5135302 (Citómetro de flujo) o por la patente US-1918351 (hemacitómetro/Cámara de Neubauer) . Estas técnicas presentan diversas desventajas y problemas. Entre los que destacan los siguientes: El conteo en cámara de Neubauer presenta las siguientes desventajas y problemas: (a) errores humanos de conteo; (b) errores estadísticos; (c) errores en el cálculo de concentración, al aplicar la fórmula matemática correspo ndiente; (d) baja reproductibilidad / alta varianza en las mediciones realizadas; (e) proceso muy tedioso y monótono para los técnicos de laboratorio; (f) proceso difícil de realizar para personas con deficiencias visuales; (g) proceso fatigante para la vista del técnico de laboratorio. El conteo en citómetro de flujo presenta las siguientes desventajas y problemas: (a) destrucción de la muestra al realizarse el conteo; 5 (b) sistema con un alto coste de mantenimiento; (c) sistema requiere calibraciones periódicas; (d) si el sistema no se usa a menudo, se estropea; (e) el sistema no permite la observación visual de las muestras por los técnicos. Las cámaras de recuento del tipo de las descritas por US 1918351 (cámara de Neubauer) son unas cámaras adaptadas al microscopio de campo claro o al de 10 contraste de fases. Consisten, en general, en un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula con unas dimensiones dadas, con una separación entre dos líneas consecutivas conocida. Para contar las células se observa el retículo al microscopio con el aumento adecuado y se cuentan las células. 15 Con base en la cantidad de células contadas, conociendo el volumen de líquido que admite el campo del retículo, se calcula la concentración de células por unidad de volumen de la muestra líquida inicial. 20 Uno de los problemas de esta técnica reside en la inexactitud que se produce cuando se realiza el conteo, ya que, se utiliza una fórmula estadística que introduce cierto error, y además también está presente el error humano. Esta inexactitud se traduce en una menor fiabilidad y reproductibilidad (fiabilidad = ausencia de error en la medida, reproductibilidad = precisión = coherencia en las mediciones de una misma 25 concentración) . US 5135302 describe un Citó metro de flujo. La citometría de flujo es una técnica de análisis celular que implica medir las características de dispersión de luz y fluorescencia que poseen las células conforme se las hace pasar a través de un rayo 30 de luz. Para su análisis por citometría de flujo, las células deben encontrarse individualmente en suspensión en un fluido. Al atravesar el rayo de luz, las células interaccionan con éste causando dispersión de la luz. Basándose en la difracción de la luz en sentido frontal, se puede evaluar el tamaño de las células que pasan y al medir la reflexión de la luz de manera lateral se evalúa la granularidad o complejidad de 35 estas. Además de la dispersión de la luz, si previamente a su análisis se coloca a las células en presencia de anticuerpos monoclonales marcados con moléculas fluorescentes, se pueden evaluar que células poseen los antígenos complementarios a los anticuerpos monoclonales usados. Un problema importante de esta técnica reside en la destrucción de la muestra que se 5 va a utilizar para realizar el conteo, ya que al exponer las células al rayo de luz y a la fluorescencia estamos destruyendo la muestra extraída. También se conocen diversas técnicas basadas en otros principios para recuento de células. Ejemplos de ello son patentes y solicitudes de patente como US 10 2007/0143033 que divulga sistemas y métodos para contar partículas por Beckam Coulter, US 2007/0012784 trata sobre la autentificación de producto por Thomas J. Mercolino, US 2008/0050619 quot;Fuel celllife counter and method of managing remaining lifequot; por Life Technologies, US 3973194 de 1976 por Daniel W. McMorris y William J. Skidmore, US 5159642 de 1992 por Tokihiro Kosaka o US 5741648 de 1998 por 15 George P. Hemstreet que describe un método de análisis celular usando análisis de imagen cuantitativo fluorescente. 20 Breve descripción de la invención La presente invención propone un sistema adaptable a cualquier microscopio o lupa. Actualmente, los sistemas de conteo automáticos celulares son máquinas cerradas que únicamente permiten realizar conteos celulares. El sistema reivindicado aprovecha los microscopios existentes y los convierte en máquinas de contar células permitiendo 25 realizar conteos y medidas en un rango más amplio. El montaje sobre el microscopio, permite además ahorrar espacio en el banco de trabajo. 30 Ventajosamente, la invención permite además el conteo automático en cualquier recipiente de profundidad conocida que pueda ser observado en el microscopio. Para conseguir estos objetivos, se han tenido que resolver varias dificultades: Problemas con la iluminación de algunos microscopios. Según el microscopio, puede ser necesario incorporar un detector de luminosidad, e incluir un parámetro de luminosidad asociado a cada perfil celular. Si cuando se intenta contar se ha cambiado la luminosidad con la que se configuró el sistema obliga a volver a definir el perfil. Problemas de desenfoque. Hay microscopios que se desenfocan en cuestión de segundos o moviendo la pletina. Se ha paliado este problema mostrando 5 instantáneamente el análisis en pantalla (si el análisis es incorrecto, normalmente es un problema de desenfoque y el usuario se da cuenta inmediatamente y lo corrige) . Problemas de artefactos, suciedad del microscopio y aberraciones de las lentes en microscopios de baja calidad, usados, etc. Se pueden definir áreas de exclusión 10 para eliminar áreas de la pantalla especialmente problemáticas y evitar que se utilicen en el conteo. Sistema de conteo de partículas adaptable a un instrumento óptico que incluye unos medios de captación de imágenes para adquirir imágenes de un recipiente con una 15 muestra a través del instrumento óptico, unos medios de visualización para visualizar imágenes adquiridas por los medios de captación asociadas a la muestra, unos medios de procesamiento de las imágenes adquiridas. Los medios de procesamiento identifican bordes de zonas de la posible partícula y permiten identificar una pluralidad de regiones de la imagen delimitadas por los bordes, para asociarlas al fondo de la 20 imagen o para asociarlas a una zona de posible partícula. También permiten comprobar si cumple con una condición preestablecida basada en al menos uno de los siguientes parámetros geométricos: longitud máxima, longitud mínima, perímetro, área o coincidencia con un patrón de contorno prefijado. También permiten contabilizar como partículas aquellas zonas que cumplen con la condición preestablecida. 25 Los medios de procesamiento pueden opcionalmente convertir la imagen adquirida a una escala de tonalidades de acuerdo con su intensidad luminosa y longitud de onda. Opcionalmente, los medios de visualización pueden marcar distintivamente las zonas 30 de posible partícula que han sido contabilizadas. Opcionalmente, los medios de visualización pueden comprender una interfaz para verificar mediante la comprobación interactiva por un usuario de una zona de posible partícula contabilizada para permitir descartarla como contabilizada. 5 Opcionalmente, los medios de procesamiento permiten además asignar un valor en la escala de tonalidades a las regiones identificadas como fondo de la imagen. 10 Ventajosamente, los medios de procesamiento pueden asociar un tamaño de partícula de acuerdo con el número de píxeles en la imagen correspondiente. Ventajosamente, los medios de procesamiento pueden calcular la concentración de partículas por unidad de volumen cuando la muestra se sitúa en un contenedor de dimensiones conocidas. 15 Favorablemente, los medios de procesamiento pueden excluir de una imagen adquirida una región de exclusión de acuerdo con lo definido por un usuario a través de la interfaz de los medios de visualización. 20 Opcionalmente, la imagen captada se convierte a una imagen en escala de grises. El sistema es aplicable en particular cuando las partículas son microorganismos biológicos. Los microorganismos biológicos pueden ser, entre...

 


Reivindicaciones:

1. Sistema de conteo de partículas adaptable a un instrumento óptico (4) que comprende.

5. unos medios de captación de imágenes (2) configurados para adquirir imágenes de un recipiente (6) con una muestra de partículas a través del instrumento óptico (4) , -unos medios de visualización (3) configurados para visualizar imágenes adquiridas por los medios de captación (2) asociadas a la muestra, -unos medios de procesamiento (1) de las imágenes adquiridas, 10 caracterizado por que 15 20 25 30 los medios de procesamiento están configurados para: identificar bordes (10) de zonas de la posible partícula identificar una pluralidad de regiones de la imagen delimitadas por los bordes, para asociarlas al fondo de la imagen (12) o para asociarlas a una zona de posible partícula (11) , comprobar si cumple con una condición prestablecida basada en al menos uno de los siguientes parámetros geométricos: longitud máxima, longitud mínima, perímetro, área o coincidencia con un patrón de contorno prefijado; contabilizar como partículas (11) aquellas zonas que cumplen con la condición preestablecida.

2. Sistema de conteo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que los medios de procesamiento (1) están configurados para convertir la imagen adquirida a una escala de tonalidades de acuerdo con su intensidad luminosa y longitud de onda.

3. Sistema de conteo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que los medios de visualización (3) están configurados además para marcar distintivamente las zonas de posible partícula (11) que han sido contabilizadas. 5 10 15 20 2.

4. Sistema de conteo de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado por que los medios de visualización (3) comprenden una interfaz para verificar mediante la comprobación interactiva por un usuario de una zona de posible partícula (11) contabilizada para permitir descartarla como contabilizada.

5. Sistema de conteo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que los medios de procesamiento (1) están configurados además para asignar un valor en la escala de tonalidades a las regiones identificadas como fondo de la imagen (12) .

6. Sistema de conteo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 3 a 5, caracterizado por que los medios de procesamiento (1) están configurados para asociar un tamaño de partícula (11) de acuerdo con el número de píxeles en la imagen correspondiente.

7. Sistema de conteo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que los medios de procesamiento (1) están configurados para calcular la concentración de partículas (11) por unidad de volumen cuando la muestra se sitúa en un contenedor de dimensiones conocidas.

8. Sistema de conteo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que los medios de procesamiento (1) están configurados para excluir de una imagen adquirida una región de exclusión (14) de acuerdo con lo definido por un usuario a través de la interfaz de los medios de visualización (3) .

9. Sistema de conteo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la imagen captada se convierte a una imagen en escala de grises. 3.

10. Sistema de conteo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que las partículas contabilizadas son microorganismos biológicos. 11. Sistema de conteo de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado por que los microorganismos biológicos se seleccionan al menos entre los siguientes: -células.

5. hongos, -algas, -plaquetas.

12. Sistema de conteo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 anteriores 9 a 10, caracterizado por que los medios de procesamiento realizan un conteo selectivo en la imagen captada al ser filtrada cuando se ilumina con luz de una longitud de onda asociada a una determinada característica de los microorganismos biológicos, si dichos microorganismos fueron previamente marcados con un marcador sensible a tal longitud de onda. 15 2.

13. Sistema de conteo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que los medios de visualización (3) están configurados para detectar la iluminación de la muestra y para modificar la intensidad luminosa aplicada a la muestra celular.

14. Sistema de conteo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que los medios de captación (2) de imágenes comprenden una cámara digital. 2.

15. Sistema de conteo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que los medios de visualización (3) de imágenes comprenden una pantalla táctil.

16. Sistema de conteo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, 30 caracterizado por que el dispositivo óptico es una lupa. 17. Sistema de conteo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado por que el dispositivo óptico es un microscopio (4) .

18. Microscopio óptico que comprende el sistema de conteo de acuerdo con la 5 reivindicación 17.

 

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