Método, instrumento y aparato para medir la concentración.

Un método para medir, en sangre, la concentración de un compuesto a analizar,

comprendiendo el método:construir un sistema de reacción que contiene el compuesto a analizar, una enzima de oxidación-reducción y unmediador de electrones; medir la concentración del compuesto a analizar utilizando un procedimientoelectroquímico;

en el que se usa un compuesto de Ru como mediador de electrones, y adicionalmente en el que el métodocomprende:

una primera etapa de producir un reductor del compuesto de Ru en el sistema de reacción;

una segunda etapa de aplicar voltaje al sistema de reacción para oxidar el reductor, y medir el valor de la corrientede respuesta correlacionado con la cantidad de electrones desprendidos por el reductor; y

una tercera etapa de calcular la concentración del compuesto a analizar en base al valor de la corriente de respuestamedida en la segunda etapa.

Método, instrumento y aparato para medir la concentración

Campo técnico

La presente invención se refiere a tecnología para medir la concentración de un compuesto a analizar (tal como glucosa o colesterol) contenido en una muestra líquida (tal como sangre u otra de tales muestras biológicas, o uno de sus preparados líquidos) .

Antecedentes de la técnica Las reacciones enzimáticas se usan como un modo de cuantificar la concentración de glucosa. En un caso típico, se usa como enzima la glucosa oxidasa (GOD) . La GOD es una enzima que está unida a flavin adenina dinucleótido (FAD) , que es una coenzima. La reacción enzimática de glucosa cuando se usa GOD avanza según la siguiente fórmula química (en la fórmula, FADH2 es la especia reducida de la FAD) .

Glucosa + GOD/FAD-o-gluconolactona + GOD/FADH2

Cuando se miden los niveles de azúcar en sangre en un entorno clínico, las concentraciones de glucosa se cuantifican a veces midiendo el cambio de absorbancia, que corresponde al cambio de concentración de glucosa. Sin embargo, el método más común es medir la concentración de glucosa por amperometría. La amperometría se emplea mucho como método para medir la concentración de glucosa en dispositivos de medida de azúcar en sangre portátiles.

Un ejemplo de cómo se mide el azúcar en sangre por amperometría se da a continuación, para el caso de medir la corriente de oxidación. En la primera etapa, se construye un sistema de reacción usando sangre, una enzima, y un medio oxidante de transferencia de electrones (mediador) . El resultado es que la reacción enzimática anteriormente mencionada avanza produciendo un mediador reductor por una reacción de oxidación-reducción entre el mediador y la FADH2 producida por esta reacción enzimática. Se usa comúnmente ferricianuro de potasio como mediador, en cuyo caso la reacción se puede representar por la siguiente fórmula química.

GOD/FADH2 + 2[Fe (CN) 6]3--GOD/FAD + 2[Fe (CN) 6]4- + 2H+

A continuación, en la segunda etapa, se aplica voltaje al sistema de reacción usando un par de electrodos, que oxida el ferrocianuro de potasio (desprende electrones) y produce ferricianuro de potasio como se muestra en la siguiente fórmula general. Los electrones que se originan en el ferrocianuro de potasio se suministran al ánodo.

[Fe (CN) 6]4--[Fe (CN) 6]3- + e-

En la tercera etapa, se mide el valor de la corriente de oxidación atribuible a la aplicación de voltaje, y se calcula la concentración de glucosa en base a este valor medido.

Cuando el azúcar en sangre se mide usando un dispositivo portátil de medida de azúcar, se usa un sensor de glucosa en el que se forma entre electrodos una capa de reactivo que contiene una enzima y un mediador, y se constituye un sistema de reacción entre los electrodos suministrando sangre a la capa de reactivo. Este sensor de glucosa se instala en un dispositivo portátil para azúcar en sangre, se aplica voltaje entre los electrodos, se mide el valor de la corriente de oxidación, y se cuantifica la concentración de glucosa en sangre en base a este valor de la corriente de oxidación.

Como se discutió anteriormente, la GOD se usa usualmente como enzima, y ferricianuro de potasio como mediador. Sin embargo, en un sistema de reacción que combina GOD con ferricianuro de potasio, se encuentran los problemas discutidos a continuación con un método para medir la concentración de glucosa por un procedimiento electroquímico, tipificado como amperometría.

El primero de estos problemas es el efecto de las substancias reductoras. Por ejemplo, si consideramos la medida de la concentración de glucosa en sangre, hay substancias reductoras (tales como ácido ascórbico, glutatión, y Fe (II) 2+) que coexisten en la sangre además de la glucosa. Si está presente una sustancia reductora distinta de cianuro de potasio cuando se aplica voltaje al sistema de reacción, los electrones que se originan en la oxidación de la substancia reductora provocada por la aplicación de voltaje se suministrarán a los electrodos además de los electrones que se originan en el ferrocianuro de potasio. Como resultado, el valor de la corriente medida incluirá una corriente de fondo (ruido) atribuible a la transferencia de electrones de la substancia reductora. Por consiguiente, la concentración de glucosa medida acabará siendo mayor que la concentración de glucosa real. Cuando mayor ser la cantidad de voltaje aplicado entre los electrodos, más tipos y cantidad de substancias reductoras que se oxidan, y más pronunciado es este error de la medida. Por lo tanto, cuando se usa ferricianuro de potasio como mediador, el azúcar en sangre no se puede medir con precisión a menos que se determine la concentración final corrigiendo el valor medido. Este efecto de las substancias reductoras no está limitado a cuando se mide el azúcar en sangre, y se encuentra similarmente con otros componentes cuando se calcula en base al valor de la corriente de oxidación.

Otro problema se refiere a la estabilidad de almacenamiento del sensor de glucosa cuando se mide la concentración de glucosa con un dispositivo portátil de medida de la concentración de glucosa en sangre y un sensor de glucosa. El ferricianuro de potasio es susceptible a los efectos de la luz y agua, y cuando se expone a estos, recibe electrones de fuentes distintas de la glucosa y se convierte en ferrocianuro de potasio reductor. Si sucede esto, entonces el sistema de reacción contendrá tanto ferrocianuro de potasio que se ha vuelto reductor por la reacción enzimática como ferrocianuro de potasio que se ha vuelto reductor por la exposición. Como resultado, así como con el problema de las substancias reductoras descrito anteriormente, la corriente de oxidación durante la aplicación de voltaje incluye una corriente de fondo que se origina en el ferrocianuro de potasio resultante de la exposición. Consecuentemente, la concentración de glucosa medida acaba siendo mayor que la concentración de glucosa real. Para minimizar este problema, el sensor de glucosa debe estar sellado en una bolsa hecha de un material que bloquea la luz, por ejemplo, de modo que la capa de reactivo en el sensor de glucosa no esté expuesta. Además, para extender la vida útil del sensor de glucosa, tiene que estar sellado en un estado hermético a la humedad realizando un desplazamiento con nitrógeno u otro de tales tratamientos para evitar la exposición a la humedad, y esto complica la fabricación y eleva el coste cuando el sensor de glucosa se produce en masa a escala industrial.

Descripción de la invención Es un objetivo de la presente invención proporcionar tecnología que reduzca el efecto de la corriente de fondo con bajo coste, y permita medir con más precisión la concentración de un compuesto a analizar en una muestra líquida.

Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para medir la concentración de un compuesto a analizar, por lo que se constituye un sistema de reacción para incluir el compuesto a analizar, una enzima de oxidación-reducción y un mediador de electrones, y a continuación se mide la concentración del compuesto a analizar utilizando un procedimiento electroquímico. Para el mediador de electrones, se hace uso de un compuesto de Ru.

El método anterior de medida de la concentración puede comprender preferentemente una primera etapa de producir un reductor del compuesto de Ru en el sistema de reacción, una segunda etapa de aplicar voltaje al sistema de reacción para oxidar el reductor, y medir el valor de la corriente de respuesta correlacionado con la cantidad de electrones desprendidos por el reductor en este momento, y una tercera etapa de calcular la concentración del compuesto a analizar en base al valor de la corriente de respuesta medida en la segunda etapa.

Electroalysis 4 (1992) 1-9 describe un método que implica la medida continua de la corriente transitoria de una etapa de aplicación de voltaje hasta la finalización de la re-oxidación y la integración de los valores de la corriente transitoria con el tiempo, lo que da como resultado un valor de carga que se correlaciona con la cantidad de electrones transferidos y la concentración de glucosa en la muestra.

Dicho método requiere una celda especialmente construida y la medida extendida de la corriente transitoria.

Con el método de la presente invención, la primera etapa se puede efectuar con el sistema de reacción en un estado de no aplicación de voltaje y efectuar a continuación la segunda etapa con el sistema de reacción en un estado de aplicación de voltaje, o la primera y segunda etapa se pueden efectuar simultáneamente con el sistema de reacción en un estado de aplicación de voltaje... [Seguir leyendo]

1. Un método para medir, en sangre, la concentración de un compuesto a analizar, comprendiendo el método: construir un sistema de reacción que contiene el compuesto a analizar, una enzima de oxidación-reducción y un mediador de electrones; medir la concentración del compuesto a analizar utilizando un procedimiento electroquímico;

en el que se usa un compuesto de Ru como mediador de electrones, y adicionalmente en el que el método comprende:

una primera etapa de producir un reductor del compuesto de Ru en el sistema de reacción;

una segunda etapa de aplicar voltaje al sistema de reacción para oxidar el reductor, y medir el valor de la corriente de respuesta correlacionado con la cantidad de electrones desprendidos por el reductor; y

una tercera etapa de calcular la concentración del compuesto a analizar en base al valor de la corriente de respuesta medida en la segunda etapa.

2. El método según la reivindicación 1, en el que el compuesto de Ru es un complejo de Ru (III) oxidante, y el reductor del compuesto es un complejo de Ru (II) reductor.

3. El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el compuesto de Ru es un complejo de Ru (III) oxidante expresado por la siguiente fórmula química:

[Ru (NH3) 5X]n+

(en la que X en la fórmula es NH3, un ión halógeno, CN, piridina, nicotinamida o H2O, y n+ en la fórmula es la valencia del complejo de Ru (III) oxidante como se determina por el tipo de X) .

4. El método según la reivindicación 2 o 3, en el que en la primera etapa el complejo de Ru (II) reductor se produce por solo dos reacciones: una reacción de oxidación del compuesto a analizar catalizada por la enzima de oxidación-reducción, y una reacción de reducción del complejo de Ru (III) oxidante.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el sistema de reacción es un sistema de reacción en fase líquida uniforme o sustancialmente uniforme en el que está dispersa una cantidad relativamente pequeña de la enzima de oxidación-reducción sustancial y uniformemente con respecto a una relativamente gran cantidad del complejo de Ru (III) oxidante.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el compuesto a analizar es glucosa, colesterol, ácido láctico o ácido ascórbico.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la enzima de oxidación-reducción se selecciona del grupo que consiste en glucosa deshidrogenasa (GDH) (incluyendo aGDH y CyGDH) , glucosa oxidasa (GOD) , colesterol deshidrogenasa, colesterol oxidasa, ácido láctico deshidrogenas, ácido láctico oxidasa, ácido ascórbico deshidrogenasa, ácido ascórbico oxidasa, alcohol deshidrogenasa, alcohol oxidasa, fructosa deshidrogenasa, ácido 3-hidroxibutírico deshidrogenasa, ácido pirúvico oxidasa, NADH oxidasa, ácido úrico oxidasa (uricasa) , ureasa, y dihidrolipoamida deshidrogenasa (diaforasa) .

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la primera etapa dura de 0 a10 segundos y el valor de la corriente de respuesta se mide por lo menos 3 segundos después del inicio de la segunda etapa.

9. El método según la reivindicación 8, en el que se mide el valor de la corriente de respuesta cuando ha pasado un periodo de 3 a 5 segundos desde el inicio de la segunda etapa.

10. Un dispositivo que comprende un aparato de medida de la concentración junto con un instrumento de análisis de la concentración, en el que:

el instrumento de análisis de la concentración comprende un substrato; por lo menos un primer y segundo electrodo formados sobre el substrato; y una capa de reactivo en forma de sólido; en el que la capa de reactivo comprende una enzima de oxidación-reducción y un compuesto de Ru, y está constituida para disolverse y construir un sistema de reacción en fase líquida cuando se suministra una muestra líquida que contiene el compuesto a analizar;

y en el que:

el aparato de medida de la concentración comprende:

un aplicador de voltaje para aplicar voltaje entre el primer y segundo electrodo; un medidor del valor de la corriente para medir el valor de la corriente de respuesta cuando se aplica voltaje entre el primer y segundo electrodo; y

un ordenador para calcular la concentración del compuesto a analizar en base al valor de la corriente de respuesta;

en el que dicho ordenador convierte el valor de la corriente de respuesta en un valor de voltaje, y chequea el valor del voltaje con una curva de calibración predeterminada que expresa la relación entre el voltaje y la concentración del compuesto a analizar.

11. El dispositivo según la reivindicación 10, en el que la capa de reactivo está constituida de tal modo que cuando se suministra la muestra líquida, la enzima de oxidación-reducción y el compuesto de Ru están presentes en el sistema de reacción en fase líquida.

12. El dispositivo según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que la enzima de oxidación-reducción es como se define en la reivindicación 7.

13. El dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el compuesto de Ru es como se define en la reivindicación 3.

14. El dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que el compuesto a analizar es como se define en la reivindicación 6.

15. El dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en el que la capa de reactivo contiene el compuesto de Ru como oxidante, y está constituido de tal modo que cuando se suministra la muestra líquida a la capa de reactivo, se produce un reductor del oxidante por solo dos reacciones: una reacción de oxidación del compuesto a analizar catalizada por la enzima de oxidación-reducción, y una reacción de reducción del compuesto de Ru, y preferentemente en el que la capa de reactivo está constituida de modo que el reductor se produce sustancial y uniformemente en cada localización del sistema de reacción en fase líquida.

16. El dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, que comprende adicionalmente un controlador para controlar la aplicación de voltaje efectuada por el aplicador de voltaje,

en el que el controlador está constituido de tal modo que el voltaje aplicado por el aplicador de voltaje se controla para que sea un voltaje constante seleccionado de un intervalo de 100 a 500 mV, preferentemente de 100 a 300 mV.

17. El dispositivo según la reivindicación 16, en el que el voltaje aplicado por el aplicador de voltaje se controla para que sea un voltaje constante seleccionado de un intervalo de 100 a 350 mV.

18. El dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, que comprende adicionalmente un controlador para controlar la aplicación de voltaje efectuada por el aplicador de voltaje,

en el que el controlador está constituido de tal modo que el voltaje aplicado por el aplicador de voltaje se controla para que sea un voltaje constante seleccionado de un intervalo de por lo menos el potencial de oxidación-reducción estándar (frente a un electrodo de hidrógeno estándar) entre el oxidante y reductor del compuesto de Ru, y menos que el potencial de oxidación-reducción estándar (frente a un electrodo de hidrógeno estándar) entre iones ferrocianuro e iones ferricianuro.

19. El dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18, que comprende adicionalmente un controlador para controlar la medida del valor de la corriente efectuada por el medidor de corriente,

en el que el controlador está constituido de tal modo que el valor de la corriente de respuesta necesario para el cálculo por el ordenador es medido por el medidor del valor de la corriente en cualquier momento entre 3 y 5 segundos después de que se suministra la muestra líquida a la capa de reactivo.