Procedimiento y dispositivo para la conservación de núcleos celulares.

Procedimiento para la crioconservación de material biológico el cual contiene células biológicas (1) conmembranas celulares (2),

núcleos celulares (3), citoplasma (4) y orgánulos celulares (5), que comprende lasetapas de:

- preparación de las células biológicas (1) de tal modo que se rompan las membranas celulares (2),

- deshidratación de los núcleos celulares (3) en la cual la deshidratación comprende una reducción de laproporción de agua, y

- ajuste de las condiciones de conservación en las cuales los núcleos celulares (3) presentan un estadocrioconservado.

Procedimiento y dispositivo para la conservación de núcleos celulares La invención se refiere a un procedimiento para la conservación de núcleos celulares de células biológicas, particularmente para la crioconservación de núcleos celulares y dado el caso de otros componentes celulares tales como, por ejemplo, orgánulos celulares y/o citoplasma, o de células biológicas desnucleadas. La invención se refiere además a un dispositivo el cual está configurado para la puesta en práctica de dicho procedimiento y particularmente para la conservación de núcleos celulares de células biológicas y dado el caso de otros componentes celulares o células biológicas desnucleadas. La invención se refiere también a un procedimiento para la regeneración o recuperación de células biológicas. Las aplicaciones de la invención se demuestran particularmente en la conservación y almacenamiento de materiales biológicos.

La crioconservación de materiales biológicos, particularmente de tejidos, grupos celulares, células o componentes celulares, es una técnica conocida desde hace decenas de años con numerosas aplicaciones en medicina, biología, biotecnología, agricultura, industria alimentaria e ingeniería ambiental (véanse, por ejemplo, las patentes US 3.648.475 A y US 2002/0177119 A1) . Aunque las células biológicas pueden almacenarse durante largos periodos de tiempo en estado congelado, por ejemplo años o decenas de años, y después de su descongelación recobrar toda su vitalidad, se han demostrado en la práctica índices de vitalidad limitados. El índice de vitalidad, es decir la proporción de células viables después de la descongelación, depende de la especie biológica y del tipo celular y puede ascender a menos de un 1% (por ejemplo, en huevos de insecto, ovocitos de mamíferos, peces o reptiles) o hasta a un 95% o más (por ejemplo, en células grasas de mamíferos) . Una serie de tipos celulares son inadecuados para la crioconservación convencional, ya que no pueden congelarse y revitalizarse. En las células animales, esto se aplica especialmente a ovocitos, mientras que las células vegetales frecuentemente no pueden congelarse manteniendo la vitalidad a causa de las vacuolas en las células. Se comprueba que existen problemas particularmente en la protección de especies, ya que para la mayoría de especies es posible una crioconservación de esperma, pero no de ovocitos. Z. He y col. ("Fertility and Sterility" vol. 79, 2003, pág. 347 y siguientes) describen la crioconservación de material nuclear de ovocitos, en la cual se aíslan cuerpos polares y pronúcleos, se transfieren en grupos a una zona pelúcida y se congelan en esta. Este procedimiento está limitado a la crioconservación de material nuclear de ovocitos y es desventajoso debido a la compleja preparación del material celular.

Para compensar la pérdida de células las cuales ya no son viables después de la descongelación, se congelan en la práctica cuantas más células mejor de la muestra para conservar, por ejemplo millones de células o más. Con el número creciente de células, crece sin embargo el tamaño de la criomuestra y por tanto el gasto de la crioconservación y el espacio necesario en el almacenamiento. También es desventajoso que en tareas de conservación especiales, tales como por ejemplo en la crioconservación de citoblastos adultos o de óvulos esenciales o productos de fusión tales como, por ejemplo, células de hibridoma, estén a disposición solo bajos números de células.

Otro problema conocido en la práctica de la crioconservación convencional consiste en la dependencia del índice de vitalidad de las condiciones de congelación y posterior descongelación de las células. Cuantas más subetapas se recorran en la congelación o descongelación y/o cuantos más agentes crioprotectores se utilicen, mayor es el estrés para las células en la crioconservación. Ya que el índice de vitalidad se reduce al crecer el estrés celular, existe hasta ahora la tendencia, particularmente en la congelación, de realizar cuantas menos subetapas en el tiempo más corto posible. Así, se ha propuesto impedir la creación de cristales de hielo en el material celular mediante una congelación prácticamente instantánea (vitrificación) y por tanto minimizar el estrés celular. Sin embargo, es desventajoso que hasta ahora se hayan realizado en la práctica enfoques exitosos para la elevación del índice de vitalidad específicamente sólo de tipos celulares o clases de muestra determinados, pero en general no fueran aplicables con la reproducibilidad deseada.

Se ha propuesto además reprimir la creación de cristales de hielo añadiendo a la muestra al menos un agente crioprotector (crioprotector) , tal como por ejemplo DMSO, glicerina o trehalosa. El crioprotector influye en la estructura de la creación de hielo dentro y fuera de las células. Sin embargo, es desventajoso que los crioprotectores utilizados hasta ahora puedan influir desventajosamente en las células e índice de vitalidad, ya que se añaden en concentraciones altas no fisiológicas (por ejemplo, de 5 a 40%) .

Otra desventaja de los crioprotectores convencionales consiste en que estos tienen una capacidad limitada de atravesar las membranas celulares (permeabilidad por membrana limitada) . Ya que para la eficacia de los crioprotectores en la crioconservación convencional es esencial que estos puedan difundirse pasivamente en las células (por ejemplo DMSO) , las sustancias con permeabilidad por membrana limitada son inadecuadas hasta ahora como crioprotectores.

Es conocido por ejemplo por la patente US 2005/0277107 A1 alimentar crioprotectores para la crioconservación de células biológicas a través de su membrana celular, para deshidratar las células y congelar las células en estado deshidratado. La aplicación de este procedimiento está sujeta en la práctica a limitaciones, ya que la alimentación de crioprotectores debe realizarse tan cuidadosamente para que las células vuelvan a ser viables después de la descongelación, y es necesaria una alta concentración de crioprotector la cual es tolerada sólo por pocos tipos celulares. Se describe un criotratamiento de moléculas de ácido nucleico utilizando crioprotectores en la patente WO 00/27361 A1.

En la congelación, debe alcanzarse hasta ahora lo más rápido posible la temperatura de crioconservación a la cual no aparecen alteraciones dentro ni fuera de las células, de modo que las células pueden mantenerse sin daños. Ya que las temperaturas por encima de -130ºC pueden dar lugar a la recristalización de dominios de hielo microscópicos, se realiza la congelación y el almacenamiento de muestras en la crioconservación convencional a temperaturas por debajo de los -140ºC, por ejemplo a -196ºC (temperatura del nitrógeno líquido) o a -145 a -160ºC en fase gaseosa enfriada (vapor de nitrógeno líquido) para conseguir un alto índice de vitalidad.

El objetivo de la invención es procurar un procedimiento mejorado para la crioconservación de materiales biológicos el cual supere las limitaciones del procedimiento de crioconservación convencional y el cual se caracterice particularmente por una proporción elevada de células vitales las cuales sean obtenibles después de la crioconservación. El procedimiento debe ser practicable particularmente con alta fiabilidad y reproducibilidad incluso con cantidades de muestra pequeñas y para tipos celulares los cuales sean inadecuados para la crioconservación convencional. El objetivo de la invención es también procurar un dispositivo mejorado para la crioconservación de materiales biológicos el cual evite las desventajas de los dispositivos convencionales de crioconservación. Estos objetivos se consiguen con procedimientos o dispositivos para crioconservación con las características de las reivindicaciones independientes. Los modos de realización y aplicaciones ventajosas de la invención se demuestran por las características de las reivindicaciones dependientes.

La invención referida al procedimiento se basa en las enseñanzas técnicas generales de someter a una célula biológica (o células biológicas) en primer lugar a una preparación en la cual se actúa de manera invasiva sobre la membrana celular de las células biológicas. Apartándose de las técnicas convencionales, las cuales se dirigen al mantenimiento de las células, se rompe la membrana celular con la preparación, en la cual pueden aparecer daños del citoplasma de las células. Mediante la rotura, se altera la membrana celular de manera que las células pierden su vitalidad. La rotura de la membrana celular comprende, por ejemplo, una perforación, una separación o una degradación (destrucción) . Ventajosamente, se facilita por tanto la provisión selectiva de... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la crioconservación de material biológico el cual contiene células biológicas (1) con membranas celulares (2) , núcleos celulares (3) , citoplasma (4) y orgánulos celulares (5) , que comprende las etapas de:

preparación de las células biológicas (1) de tal modo que se rompan las membranas celulares (2) ,

deshidratación de los núcleos celulares (3) en la cual la deshidratación comprende una reducción de la proporción de agua, y

ajuste de las condiciones de conservación en las cuales los núcleos celulares (3) presentan un estado crioconservado.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el cual la preparación de células biológicas (1) comprende una rotura de la membrana celular la cual hace perder la vitalidad de las células.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el cual la preparación de las células biológicas (1) comprende al menos una de las etapas: enfriamiento de las células biológicas (1) , destrucción mecánica de las membranas celulares (2) , destrucción química de las membranas celulares (2) , destrucción osmótica de las membranas celulares (2) , destrucción de los componentes citoplasmáticos de las células biológicas (1) en el entorno de los núcleos celulares (3) ,

trituración del material celular biológico el cual contiene las células biológicas (1) en estado congelado, y separación de los núcleos celulares (3) del resto de componentes de las células biológicas.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el cual la deshidratación de los núcleos celulares (3) comprende al menos una de las etapas de:

ajuste de una temperatura de deshidratación en la cual se realiza una recristalización del agua congelada en el entorno de los núcleos celulares (3) ,

provisión de una sustancia deshidratante la cual causa la deshidratación de los núcleos celulares (3) en el entorno de los núcleos celulares (3) ,

provisión de una sustancia estabilizante la cual penetra en los núcleos celulares (3) y desplaza el agua en los mismos, y

sublimación de agua del entorno de los núcleos celulares (3) en estado congelado a presión reducida.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el cual

la temperatura de deshidratación se ajusta en el intervalo de temperatura de por debajo de 0ºC y por encima de -80ºC, particularmente por encima de -40ºC y/o

se ajusta un ciclo de temperatura de deshidratación en el cual la temperatura de deshidratación se altera varias veces y/o se ajusta una temperatura elevada por encima del punto de congelación del agua.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el cual

durante el ajuste de la temperatura elevada por encima del punto de congelación del agua, se realiza un intercambio de sustancia con el entorno de los núcleos celulares (3) .

7. Procedimiento según la reivindicación 4, en el cual la sustancia deshidratante se selecciona del grupo de sustancias el cual comprende alcoholes, proteínas,

azúcares, electrolitos y polímeros, y/o la sustancia estabilizante se selecciona del grupo el cual comprende alginato, nanopartículas, matrices, celulosa, polímeros y geles.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el cual

la deshidratación de los núcleos celulares (3) se realiza mientras los núcleos celulares (3) se encuentran en el material celular biológico el cual contiene componentes celulares de las células biológicas (1) .

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el cual la deshidratación de los núcleos celulares (3) se realiza después de haber separado los núcleos celulares

(3) del material biológico el cual contiene las células biológicas (1) .

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el cual el ajuste de las condiciones de conservación comprende:

el ajuste de una temperatura de almacenamiento de los núcleos celulares (3) la cual se selecciona por debajo de -80ºC, particularmente por debajo de -130ºC.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, con al menos una de las etapas de: compactación de los núcleos celulares (3) , y deposición individual de los núcleos celulares (3) , y se someten al menos uno de membranas celulares (2) , citoplasma (4) , orgánulos celulares (5) y parte de

los mismos a deshidratación y crioconservación.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el cual:

los núcleos celulares (3) , las membranas celulares (2) , el citoplasma (4) , los orgánulos celulares (5) y/o partes de los mismos se separan entre sí y se crioconservan separados de los núcleos celulares (3) .

13. Dispositivo (100) para la crioconservación de núcleos celulares (3) de células biológicas (1) el cual comprende:

un equipo de preparación (10) el cual se proporciona para la preparación de células biológicas (1) de tal manera que se rompan las membranas celulares (2) de las células biológicas (1) ,

un equipo de deshidratación (20) el cual se proporciona para la deshidratación de los núcleos celulares (3) , en el cual la deshidratación comprende una reducción de la proporción de agua, y

un equipo de conservación (30) el cual se proporciona para el ajuste de las condiciones en las cuales los núcleos celulares (3) presentan un estado crioconservado.

14. Dispositivo según la reivindicación 13, en el cual

se proporcionan varios dispositivos de conservación (30) los cuales se configuran para el ajuste de las condiciones en las cuales al menos uno de las membranas celulares (2) , citoplasma (4) , orgánulos celulares (5) y las partes de los mismos presentan un estado crioconservado.

DOCUMENTOS INDICADOS EN LA DESCRIPCIÓN

En la lista de documentos indicados por el solicitante se ha recogido exclusivamente para información del lector, y no es parte constituyente del documento de patente europeo. Ha sido recopilada con el mayor cuidado; sin embargo, la EPA no asume 5 ninguna responsabilidad por posibles errores u omisiones.

Documentos de patente indicados en la descripción • US 3648475 A [0002] • US 20050277107 A1 [0006]

• US 20020177119 A1 [0002] • WO 0027361 A1 [0006]

Literatura no especificada en la descripción de la patente