Activación de la pan-quinasa y evaluación de las vías de señalización.

Un metodo para determinar el estado de activacion de una proteina de senalizacion de una via de transducción desenales en una muestra que contiene leucocitos que comprende:

a) activar las proteinas activables de al menos una via de transduccion de senales en los leucocitos de lamuestra exponiendo la muestra que contiene leucocitos a un activador de pan-quinasa;b) conservar la muestra activada con un conservante;

c) desenmascarar epitopos intracelulares de los leucocitos conservados en la muestra;

d) poner en contacto los epitopos intracelulares desenmascarados de los leucocitos conservados con unapluralidad de moleculas de captura marcadas con fluorescencia, donde dicha pluralidad de moleculas decaptura comprende al menos dos moleculas de captura diferentes capaces de unirse al estado activado deal menos dos diferentes epitopos intracelulares desenmascarados de los leucocitos conservados yactivados en la muestra, y al menos una molecula de captura de control, en donde la molecula de capturade control se une a un epitopo en los leucocitos conservados que es no es activado por el activador de panquinasa,

e) detectar la intensidad de fluorescencia media de la poblacion conservada y activada de leucocitoscapturados por la union de las moleculas de captura al estado activado de los epitopos intracelularesdesenmascarados;

f) detectar la intensidad de fluorescencia media de la poblacion de los leucocitos conservados capturadospor la union de la molecula de captura de control; y

g) comparar la intensidad de la poblacion de los leucocitos conservados y activados detectados, capturadospor las moleculas de captura, con la intensidad de fluorescencia media de la poblacion de los leucocitosdetectados conservados, capturados por la molecula de captura de control.

Activación de la pan-quinasa y evaluación de las vías de señalización Ciertos modos de realización de la presente invención hacen referencia a métodos para determinar el estado de activación de una proteína de señalización de vía de transducción de señales. En al menos algunos modos de realización, se proporcionan métodos para la monitorización de la eficacia de un inhibidor de transducción de señales en un paciente. La presente invención además proporciona ensayos de alta sensibilidad, útiles en poblaciones de pacientes en las que resulta difícil obtener una muestra celular grande, por ejemplo, en neonatos. Ciertos modos de realización de la presente invención hacen referencia a métodos para la identificación de nuevos inhibidores de proteínas de las vías de transducción de señales. Algunos modos de realización de la invención hacen referencia a métodos para detectar sepsis en una muestra de un paciente.

Muchas enfermedades se caracterizan por interrupciones en las vías de señalización celular que conducen a patologías que incluyen un crecimiento y proliferación descontrolada de células cancerígenas, además de procesos de inflamación anormal. Tales defectos pueden incluir cambios en la actividad de las quinasas lipídicas, un tipo de enzimas que cataliza la transferencia de grupos fosfatos a lípidos. Estos lípidos fosforilados, a su vez, reclutan proteínas aguas abajo (downstream) que propagan las señales que se originan a partir de los mediadores de señalización aguas arriba (upstream) , tales como receptores tirosina quinasa y receptores antigénicos. Por ejemplo, la proteína quinasa Akt es reclutada por fosfolípidos hasta la membrana plasmática donde es activada. Una vez activada, la Akt juega un papel central en la supervivencia tanto de los tejidos normales, como de los cancerígenos.

Las fosfoinositol 3-quinasas (PI3Ks) son una familia de quinasas lipídicas que juegan un papel fundamental en la señalización de vías aguas abajo de múltiples receptores de la superficie celular, que controlan el crecimiento, la proliferación y la supervivencia celular. Las PI3Ks activas consisten en dos sub-unidades: una sub-unidad reguladora con un peso molecular de 85 o 55 kD (p85 o p55) , y una sub-unidad catalítica con un peso molecular de 110 kD (p110) . Aunque las sub-unidades reguladoras son cruciales para la función de las PI3K, estas sub-unidades reguladoras también transmiten señales independientemente de la PI3-quinasa (Ueki et al., J Biol. Chem. Noviembre 28; 278 (48) : 48453-66 (2003) ) . Recientemente, se ha demostrado que la p85-alfa puede inducir la apoptosis a través del factor de transcripción inducible NAFT3 (Factor nuclear de linfocitos T activados, NAFT por sus siglas en inglés) , independiente de la vía de señalización de la PI3K (Song et al., Mol. Cell. Biol. 27: 2713-2731 (2007) ) .

La vía de PI3K se encuentra implicada en diversas enfermedades humanas, incluyendo la diabetes, fallo cardiaco y muchos tipos de cáncer (ver, por ejemplo, Kim et al., Curr. Opin. Investig. Drugs. Diciembre; 6 (12) : 1250-8 (2005) ) , que incluyen el cáncer colorectal, leucemia mieloide aguda, cáncer de mama, gliomas, y cáncer de ovarios. Los inhibidores de PI3K se están estudiando como una terapia potencial en una variedad de enfermedades que incluyen el cáncer, fallo cardiaco y trastornos inflamatorios/autoinmunes.

La vía de transducción de señales de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK, por sus siglas en inglés) , se encuentra también implicada en la proliferación y diferenciación celular. Esta vía desempeña un papel en la regulación de la maduración meiótica de ovocitos (Moriguchi et al., Adv. Pharmacol. 36:121-137 (1996) ; Murakami et al., Methods in Enzymology 283:584-600 (Dunphy, ed., 1997) ; Matten et al., Seminars in Dev. Biol. 5:173-181 (1994) ) .

La vía MAPK está también implicada en la regulación del crecimiento, supervivencia y diferenciación celular (Lewis et al., supra) . Además, se han detectado MAPK activada y/o un elevado nivel de expresión de MAPK en una variedad de tumores en humanos (Hoshino, R. et al., Oncogene 18:813-822 (1999) ; Salh, B. et al., Anticancer Res.

19: 741-48 (1999) ; Sivaraman, V. S. et al., J. Clin. Invest. 99:1478-483 (1997) ; Mandell, J. W et al., Am. J. Pathol. 153:1411-23 (1998) ; Licato, L. L. et al. Digestive Diseases and Sciences 43, 1454-1464 (1998) ) , y pueden estar asociadas a actividades invasivas, metastásicas y angiogénicas de las células tumorales. Por tanto, la activación inadecuada de la vía de la MAPK es una característica esencial común a muchos tipos de tumores. Por esta razón, los participantes en esta vía de señalización, tales como MEK, son dianas potenciales para la terapia contra el cáncer.

Varios grupos han desarrollado ensayos para monitorizar inhibidores de diversas vías de transducción de señales. Un ensayo, que detecta la actividad de inhibidores de la vía de PI3K>Akt, utiliza plaquetas de sangre periférica ( (Bowers et al. Mol., Cancer Ther. 6:2600-2607 (2007) ) . Sin embargo, este ensayo únicamente mide el impacto de la inhibición de esta vía (inhibición de la activación de plaquetas) , y no monitoriza directamente la fosforilación (activación) de las proteínas de señalización diana. Además, las dificultades técnicas hacen que la medición de esta vía utilizando plaquetas de sangre periférica suponga un desafío.

De forma similar, West et al. (J. Trauma Injur y , Inf. and Crit Care 62:805-811 (2008) ) , describieron un ensayo basado en citometría de flujo para detectar sepsis, que utilizaba la carencia de activación de monocitos en sangre periférica (medida por fosforilación de p38 y ERK) , seguido de exposición in vitro a lipopolisacáridos (LPS) . Sin embargo, en este ensayo no se confirmó especificidad, y no se observó la activación temprana de ERK o la activación secundaria de todas las vías de las tres MAPK. Este ensayo fue también suscepible de niveles basales inaceptablemente elevados para un ensayo clínicamente relevante. Por ejemplo, a partir de sus resultados los autores concluyen que en controles normales, el porcentaje de monocitos que expresan fosfo-ERK aumenta desde el 35% sin estimulación con los LPS, hasta el 58% positivo después de tratamiento con LPS in vitro (medido en un punto de tiempo de 15 min después de la adición de LPS) . Por el contrario, los pacientes presumiblemente sépticos mostraron un 25% de monocitos de P-ERK antes de la adición de LPS, que aumentó en menos de un 10% a continuación de la adición de LPS in vitro.

La monitorización farmacodinámica de los agentes dirigidos a moléculas en la sangre periférica de pacientes con leucemia, utilizando citometría de flujo, se encuentra ya descrita (David W. Hedley et al. Toxicol. Pathol. 36: 133-139 (2008) ) .

Existe la necesidad en el arte de un ensayo que pueda monitorizar de forma precisa la eficacia de un inhibidor de transducción de señales en un paciente. Existen otras necesidades para dectectar y monitorizar ciertas enfermedades y trastornos que están asociados con la activación aberrante de una proteína de señalización de la vía de transducción de señales. Los ensayos actuales se basan en técnicas de inmunoblot que no pueden identificar el tipo de célula que realmente genera la respuesta en una población de células mixta. Además, al tener que eliminar el fármaco de las muestras, estos ensayos resultan engorrosos y están sujetos a una carencia de sensibilidad. Los ensayos sensibles se requieren especialmente en pacientes en los que obtener una muestra grande es difícil, por ejemplo, en neonatos.

En un modo de realización, la presente invención proporciona un método para determinar el estado de activación de una proteína de señalización de la vía de transducción de señales en una muestra que contiene leucocitos (es decir, una muestra de sangre) que comprende: a) activar las proteínas activables de al menos una vía de transducción de señales en los leucocitos de la muestra, exponiendo la muestra a un activador de pan-quinasa; b) conservar la muestra con un conservante; c) desenmascarar epítopos intracelulares de los leucocitos conservados en la muestra; d) poner en contacto los epítopos intracelulares de los leucocitos conservados con una pluralidad de moléculas de captura marcadas con fluorescencia, donde dichas moléculas de captura comprenden, al menos, dos moléculas de captura diferentes, capaces de unirse al estado activado de al menos dos epítopos intracelulares desenmascarados diferentes de leucocitos conservados y activados en la muestra, y al menos una molécula de captura de control, en donde la molécula de captura de control se une a un epítopo en los leucocitos conservados que... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar el estado de activación de una proteína de señalización de una vía de transducción de señales en una muestra que contiene leucocitos que comprende:

a) activar las proteínas activables de al menos una vía de transducción de señales en los leucocitos de la muestra exponiendo la muestra que contiene leucocitos a un activador de pan-quinasa;

b) conservar la muestra activada con un conservante;

c) desenmascarar epítopos intracelulares de los leucocitos conservados en la muestra;

d) poner en contacto los epítopos intracelulares desenmascarados de los leucocitos conservados con una pluralidad de moléculas de captura marcadas con fluorescencia, donde dicha pluralidad de moléculas de captura comprende al menos dos moléculas de captura diferentes capaces de unirse al estado activado de al menos dos diferentes epítopos intracelulares desenmascarados de los leucocitos conservados y activados en la muestra, y al menos una molécula de captura de control, en donde la molécula de captura de control se une a un epítopo en los leucocitos conservados que es no es activado por el activador de panquinasa,

e) detectar la intensidad de fluorescencia media de la población conservada y activada de leucocitos capturados por la unión de las moléculas de captura al estado activado de los epítopos intracelulares desenmascarados;

f) detectar la intensidad de fluorescencia media de la población de los leucocitos conservados capturados por la unión de la molécula de captura de control; y

g) comparar la intensidad de la población de los leucocitos conservados y activados detectados, capturados por las moléculas de captura, con la intensidad de fluorescencia media de la población de los leucocitos detectados conservados, capturados por la molécula de captura de control.

2. Método según la reivindicación 1, que además comprende:

h) evaluar la intensidad de fluorescencia media comparada de la población medida en la etapa g) con respecto a la intensidad de fluorescencia media comparada de la población medida en una muestra de referencia no activada.

3. Método según la reivindicación 2, en donde la muestra es de un paciente y la evaluación de la intensidad de fluorescencia media de la población indica que el paciente tiene una enfermedad o condición asociada a la transducción de señales cuando la intensidad de fluorescencia media de la población de las muestras activadas y no activadas son aproximadamente comparables.

4. Método según la reivindicación 3, en donde la enfermedad o condición asociada a la transducción de señales es inflamación, trastorno autoinmune, alergia, fiebre, sepsis, cáncer, diabetes, o fallo cardiaco.

5. Método según la reivindicación 4, que además comprende la repetición de las etapas a) a la g) con una muestra del paciente después de que el paciente haya recibido un agente terapéutico para tratar la inflamación, fiebre, sepsis, cáncer, diabetes, o fallo cardiaco y monitorizar la efectividad de dicho agente terapéutico monitorizando un cambio en la intensidad de fluorescencia media de la población entre las muestras activadas y no activadas.

6. Método según la reivindicación 4, en donde la muestra procede de un paciente que recibe un inhibidor de quinasa.

7. Método según la reivindicación 2, en donde la muestra ha sido expuesta a un inhibidor putativo de quinasa y donde el método además comprende la determinación de la efectividad del inhibidor de quinasa cuando la muestra activada no demuestra un cambio en la intensidad de fluorescencia media de la población de las proteínas activables de al menos una vía de señal de transducción.

8. Método según la reivindicación 7, en donde el inhibidor putativo de quinasa es un inhibidor putativo de ERK o PI3K, que además comprende la monitorización de la inhibición de la S6 ribosómica, en donde la inhibición tanto de ERK como de PI3K se requiere para la inhibición de la S6 ribosómica mediante:

i) exposición de la muestra a un inhibidor de ERK conocido y a un inhibidor putativo de PI3K y monitorización de la inhibición de la S6 ribosómica; o ii) exposición de la muestra a un inhibidor de PI3K conocido y a un inhibidor putativo de ERK y monitorización de la inhibición de la S6 ribosómica.

9. Método según la reivindicación 1, que comprende la medición de la actividad de al menos una segunda vía de transducción de señales.

10. Método según la reivindicación 1, en donde dicha detección se logra por citometría.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha proteína de la vía de transducción de señales se selecciona del grupo que consiste en PI3K, proteína S6 ribosómica, p44/42 MAP quinasa, TYK2, p38 MAP quinasa, PKC, PKA, SAPK, ELK, JNK, cJun, RAS, Raf, MEK 1/2, MEK 3/6, MEK 4/7, ZAP-70, LAT, SRC, LCK, ERK 1/2, Rsk 1, PYK2, SYK, PDK1, GSK3, FKHR, AFX, PLCg, PLCy, FAK, CREB, aIIIº3, FcERI, BAD, p70S6K,

STAT1, STAT2, STAT3, STAT5, STAT6, o combinaciones de las mismas.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho activador de pan-quinasa es un activador del receptor tipo Toll 4 (TLR4) o lipopolisacárido (LPS) .

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la molécula de captura es un anticuerpo o antígeno que se une a un fragmento de la misma.

14. Método según la reivindicación 13, en donde dicho anticuerpo es específico para un estado de fosforilación de dicha proteína de la vía de transducción de señales, en donde dicho anticuerpo específico al estado de fosforilación se selecciona de forma opcional del grupo que consiste en anti-fosfo-p44/42 MAP quinasa (Thr202/Tyr204) , antifosfo-TYK2 (Tyr1054/1055) , anti-fosfo-p38 MAP quinasa (Thr180/Tyr182) , anticuerpo de sustrato fosfo-PKC-PAN, anticuerpo de sustrato fosfo-PKA-, anti-fosfo-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) , anti-fosfo-tirosina (P-tyr-100) , anti-p44/42

MAPK, anti-fosfo-MEK1/2 (Ser217/221) , anti-fosfo-p90RSK (Ser381) , anti-p38 MAPK, anti-JNK/SAPK, antifosfo-Raf1 (Ser259) , anti-fosfoElk-1 (Ser383) , anti-fosfo-CREB (Ser133) , antifosfoSEK1/MKK4 (Thr261) , anti-fosfo-Jun (Ser 63) , anti-fosfoMKK3/MKK6 (Ser189/207) , anti-AKT, anti-fosfo FKHR, anti-FKHR, antifosfo-Gsk3 alp21, anti-pAFX, anti-PARP, anti-BAD, anti-BADser 112, anti-BADser 136, anti-fosfo-BADser 155, anti-p27, anti-p21, anti-cFLIP, antiMYC, anti-p53, anti-NFKB, anti-Ikka, anti-Ikkº, anti-fosfo-tirosina, y anti-fosfo-treonina.